Когерентная микроскопия комбинационного рассеяния света - Coherent Raman scattering microscopy

Одновременная двухцветная визуализация z-стека стимулированного комбинационного рассеяния без меток уха мыши (красный: белок, зеленый: липид, изображение 220 на 220 микрон, общая глубина 60 микрон, время пребывания пикселя 2 микросекунды).

Когерентное комбинационное рассеяние света (CRS) микроскопия - это метод многофотонной микроскопии, основанный на комбинационно- активных колебательных модах молекул . Двумя основными методами в CRS-микроскопии являются вынужденное комбинационное рассеяние (SRS) и когерентное антистоксово комбинационное рассеяние (CARS) . SRS и CARS были теоретически предсказаны и экспериментально реализованы в 1960-х годах. В 1982 году был продемонстрирован первый микроскоп CARS. В 1999 г. в лаборатории Сяоляна Сунни Се в Гарвардском университете была разработана CARS-микроскопия с использованием коллинеарной геометрии и объектива с высокой числовой апертурой . Это продвижение сделало технику более совместимой с современными лазерными сканирующими микроскопами . С тех пор популярность CRS в биомедицинских исследованиях начала расти. CRS в основном используется для изображения липидов, белков и других биомолекул в живых или фиксированных клетках или тканях без маркировки или окрашивания . CRS также может использоваться для изображения образцов, помеченных рамановскими тегами, что позволяет избежать помех от других молекул и обычно позволяет получать более сильные сигналы CRS, чем обычно получаемые для обычных биомолекул. CRS также находит применение в других областях, таких как материаловедение и экология.

Задний план

Энергетические диаграммы процессов спонтанного и когерентного комбинационного рассеяния света.

Когерентное комбинационное рассеяние света основано на комбинационном рассеянии света (или спонтанном комбинационном рассеянии света). В режиме спонтанного комбинационного рассеяния света используется только один лазер с монохроматическим возбуждением. Интенсивность сигнала спонтанного комбинационного рассеяния света линейно растет со средней мощностью лазера с непрерывной накачкой . В CRS два лазера используются для возбуждения определенных колебательных мод молекул, которые необходимо отобразить. Лазер с более высокой энергией фотонов обычно называют лазером накачки, а лазер с более низкой энергией фотонов - стоксовым лазером. Чтобы произвести сигнал, их разность энергий фотонов должна соответствовать энергии колебательной моды:

${\ displaystyle E_ {Raman} = E_ {насос} -E_ {Stokes}}$ ,

где . ${\ displaystyle E_ {Raman} = \ hbar \ Omega, \ E_ {pump} = \ hbar \ omega _ {pump}, \ E_ {Stokes} = \ hbar \ omega _ {Stokes}}$

CRS - это нелинейный оптический процесс , где уровень сигнала обычно является функцией произведения мощностей лазеров накачки и стоксова лазера. Следовательно, большинство экспериментов по микроскопии CRS выполняется с помощью импульсных лазеров , где более высокая пиковая мощность значительно улучшает уровни сигнала CRS.

Когерентная антистоксова рамановская микроскопия (КАРС) микроскопия

АВТОМОБИЛИ с прямым и эпи-обнаружением

В CARS антистоксовы фотоны (с большей энергией и меньшей длиной волны, чем у накачки) обнаруживаются как сигналы.

${\ displaystyle E_ {CARS} = E_ {насос} + \ Omega = 2 \ times E_ {насос} -E_ {Stokes}}$

В CARS-микроскопии обычно есть два способа обнаружить вновь генерируемые фотоны. Один называется CARS с прямым обнаружением, другой - CARS с обнаружением эпи. В CARS с прямым детектированием генерируемые фотоны CARS вместе с лазером накачки и стоксовым лазером проходят через образец. Лазеры накачки и стоксовы лазеры полностью блокируются режекторным фильтром с высокой оптической плотностью (OD) . Фотоны CARS затем обнаруживаются фотоумножителем (ФЭУ) или камерой CCD . В CARS, обнаруживаемых эпи, обратно рассеянные фотоны CARS перенаправляются дихроичным зеркалом или поляризационным светоделителем . После использования фильтров с высоким OD для блокировки обратно-рассеянных лазеров накачки и стоксовых лазеров вновь сгенерированные фотоны обнаруживаются ФЭУ. Интенсивность сигнала КАРС имеет следующую взаимосвязь с интенсивностями накачки и стоксова лазера , числом молекул в фокусе лазера и комбинационной восприимчивостью молекулы третьего порядка : ${\ displaystyle I_ {pump}, I_ {Stokes}}$${\ displaystyle N}$${\ displaystyle \ chi _ {Raman} ^ {(3)}}$

${\ displaystyle I_ {CARS} \ propto (N \ chi _ {Raman} ^ {(3)}) ^ {2} I_ {pump} ^ {2} I_ {Stokes}}$

Отношение сигнал / шум (SNR), которое является более важной характеристикой в ​​экспериментах по визуализации, зависит от квадратного корня из числа генерируемых фотонов CARS, которое приведено ниже:

${\ displaystyle SNR_ {CARS} \ propto N \ chi _ {Raman} ^ {(3)} I_ {pump} {\ sqrt {I_ {Stokes}}}}$

Существуют и другие нелинейные оптические процессы, которые также генерируют фотоны на антистоксовой длине волны. Эти сигналы обычно называют фоном нерезонансного (NR) четырехволнового смешения (FWM) в CARS микроскопии. Этот фон может мешать сигналу CARS конструктивно или деструктивно. Однако проблему можно частично обойти путем вычитания резонансных и внерезонансных изображений или использования математических методов для получения изображений без фона.

Микроскопия вынужденного комбинационного рассеяния света (ВКР)

В SRS интенсивность передачи энергии от длины волны накачки к длине волны стоксова лазера измеряется как сигнал. Есть два способа измерения сигналов SRS: один - это измерение увеличения мощности стоксова лазера, которое называется усилением рамановского рассеяния (SRG). Другой - измерение уменьшения мощности лазера накачки, которое называется вынужденными рамановскими потерями (SRL). Поскольку изменение мощности составляет порядка от 10 ^-3 до 10 ^-6 по сравнению с исходной мощностью лазеров накачки и Стокса, для выделения сигналов SRS обычно используется схема передачи модуляции. Сигнал ВКР зависит от мощности лазера накачки и стоксова излучения следующим образом:

${\ displaystyle I_ {SRS} \ propto N \ chi _ {Raman} ^ {(3)} I_ {pump} I_ {Stokes}}$

Дробовой шум ограничено обнаружение может быть достигнуто , если электронный шум от детекторов уменьшается значительно ниже оптического шума и лазеры дробовой шум ограничены на частоте обнаружения (частотная модуляция). В случае ограниченного дробового шума отношение сигнал / шум (SNR) SRS равно

${\ displaystyle SNR_ {SRL} \ propto N \ chi _ {Raman} ^ {(3)} {\ sqrt {I_ {pump}}} I_ {Stokes}}$

${\ displaystyle SNR_ {SRG} \ propto N \ chi _ {Raman} ^ {(3)} I_ {pump} {\ sqrt {I_ {Stokes}}}}$

Сигнал SRS свободен от нерезонансного фона, который мешает микроскопии CARS, хотя может существовать гораздо меньший нерезонансный фон от других оптических процессов (например, перекрестная фазовая модуляция , многоцветное многофотонное поглощение ).

SRS может быть обнаружен как в прямом, так и в эпи направлениях. При прямом обнаружении SRS модулированный лазер блокируется режекторным фильтром с высоким OD, а другой лазер измеряется фотодиодом. Модуляция, передаваемая от модулированного лазера к исходному немодулированному лазеру, обычно извлекается синхронным усилителем из выхода фотодиода. В SRS, обнаруживаемой эпи, обычно существует два метода обнаружения сигнала SRS. Один из методов заключается в обнаружении света, рассеянного назад перед объективом, с помощью фотодиода с отверстием в центре. Другой метод аналогичен КАРС-микроскопии с обнаружением epi, когда обратно рассеянный свет проходит через объектив и отклоняется в сторону светового пути, обычно с комбинацией поляризационного светоделителя и четвертьволновой пластинки. Затем стоксов лазер (или лазер накачки) обнаруживается после фильтрации накачки (или стоксов лазера).

Двухцветная, многоцветная и гиперспектральная микроскопия CRS

Одна пара длин волн лазера дает доступ только к одной частоте колебаний. Получение изображений образцов с различным волновым числом может обеспечить более конкретное и количественное химическое отображение образца. Это может быть достигнуто путем построения изображений одного за другим с разными волновыми числами. Эта операция всегда включает в себя какой-либо тип настройки: настройку одной из длин волн лазера, настройку устройства спектральной фильтрации или настройку временной задержки между лазером накачки и стоксовым лазером в случае спектрально-фокусирующего CRS. Другой способ выполнения многоцветной CRS - это использование одного пикосекундного лазера с узкой спектральной полосой пропускания (<1 нм) в качестве накачки или стоксова излучения и другого лазера с широкой спектральной полосой пропускания. В этом случае спектр передаваемого широкополосного лазера может быть расширен решеткой и измерен решеткой детекторов.

Спектрально-фокусирующий CRS

CRS обычно используют лазеры с узкополосными лазерами, ширина полосы которых <1 нм, для поддержания хорошего спектрального разрешения ~ 15 см ^-1 . Лазеры с полосой пропускания менее 1 нм являются пикосекундными лазерами. В спектрально-фокусирующем CRS фемтосекундные лазеры накачки и стоксовы лазеры одинаково линейно чирпируются в пикосекундные лазеры. Эффективная полоса пропускания становится меньше, и, следовательно, высокое спектральное разрешение может быть достигнуто таким образом с помощью фемтосекундных лазеров, которые обычно имеют широкую полосу пропускания. Регулировка волнового числа спектрально-фокусирующего CRS может быть достигнута как за счет изменения центральной длины волны лазеров, так и за счет изменения задержки между лазером накачки и стоксовым лазером.

Приложения

Когерентная рамановская гистология

Одним из основных приложений CRS является гистология без меток, которую также называют гистологией когерентного комбинационного рассеяния или иногда гистологией стимулированного комбинационного рассеяния. В CRH изображения CRS получают на изображениях липидов и белков, и после некоторой обработки изображений можно получить изображение, подобное окрашиванию H&E . В отличие от окрашивания H&E, CRH можно проводить на живых и свежих тканях и не требует фиксации или окрашивания.

Клеточный метаболизм

Метаболизм малых молекул, таких как глюкоза, холестерин и лекарства, изучается с помощью CRS в живых клетках. CRS обеспечивает способ измерения молекулярного распределения и количеств с относительно высокой производительностью.

Миелиновая визуализация

Миелин богат липидами. CRS обычно используется для визуализации миелина в живых или фиксированных тканях для изучения нейродегенеративных заболеваний или других нервных расстройств.

Фармацевтические исследования

CRS также может изучать функции лекарств. Например, противолейкозный препарат иматиниб изучается с помощью SRS в клеточных линиях лейкемии. Исследование выявило возможный механизм его метаболизма в клетках и дало представление о способах повышения эффективности препарата.

Рамановские теги

Несмотря на то, что CRS позволяет создавать изображения без меток, рамановские теги также могут использоваться для усиления сигнала для определенных целей. Например, дейтерированные молекулы используются для сдвига рамановского сигнала в полосу, где отсутствуют помехи от других молекул. Специально разработанные молекулы, содержащие изотопы, могут быть использованы в качестве рамановских тегов для получения супермультиплексирующего многоцветного изображения с SRS.

Сравнение с конфокальной рамановской микроскопией

В конфокальной рамановской микроскопии обычно используются лазеры непрерывного действия для получения спектра спонтанного комбинационного рассеяния в широком диапазоне волновых чисел для каждой точки изображения. Сканирование всего образца занимает много времени, поскольку для сбора данных каждому пикселю требуются секунды. Весь процесс визуализации длится долго, поэтому он больше подходит для неподвижных образцов. CRS, с другой стороны, измеряет сигналы по единственному волновому числу, но обеспечивает быстрое сканирование. Если требуется больше спектральной информации, можно использовать многоцветный или гиперспектральный CRS, и скорость сканирования или качество данных будут соответственно скомпрометированы.

Сравнение SRS и CARS

В микроскопии CRS мы можем рассматривать SRS и CARS как два аспекта одного и того же процесса. Сигнал CARS всегда смешивается с нерезонансным четырехволновым смешанным фоном и имеет квадратичную зависимость от концентрации отображаемых химических веществ. SRS имеет гораздо меньший фон и линейно зависит от концентрации отображаемого химического вещества. Следовательно, SRS больше подходит для количественной визуализации, чем CARS. Что касается прибора, SRS требует модуляции и демодуляции (например, синхронный усилитель или резонансный детектор). Для многоканальной визуализации SRS требует многоканальной демодуляции, в то время как CARS требуется только массив PMT или CCD. Поэтому для SRS требуются более сложные приборы, чем для CARS.

Что касается чувствительности, SRS и CARS обычно обеспечивают одинаковую чувствительность. Их различия в основном связаны с методами обнаружения. В CARS-микроскопии PMT, APD или CCD используются в качестве детекторов для обнаружения фотонов, генерируемых в процессе CARS. Чаще всего используются ФЭУ из-за их большой зоны обнаружения и высокой скорости. В SRS микроскопии фотодиоды обычно используются для измерения интенсивности лазерного луча. Из-за таких различий приложения CARS и SRS также различаются.

ФЭУ обычно имеют относительно низкую квантовую эффективность по сравнению с фотодиодами. Это отрицательно повлияет на ОСШ микроскопии CARS. ФЭУ также имеют пониженную чувствительность для лазеров с длиной волны более 650 нм. Следовательно, с обычно используемой лазерной системой для CRS ( Ti-сапфировый лазер ), CARS в основном используется для изображения в области высоких волновых чисел (2800–3400 см ^-1 ). SNR микроскопии CARS обычно оставляет желать лучшего для изображений отпечатков пальцев (400–1800 см ^-1 ).

В SRS-микроскопии в качестве детекторов в основном используются кремниевые фотодиоды . Si-фотодиоды имеют гораздо более высокую квантовую эффективность, чем ФЭУ, что является одной из причин того, что SNR SRS во многих случаях может быть лучше, чем CARS. Si-фотодиоды также страдают пониженной чувствительностью, когда длина волны лазера превышает 850 нм. Однако чувствительность все еще относительно высока и позволяет получать изображения в области отпечатков пальцев (400–1800 см ^-1 ).

Смотрите также

Рекомендации