Т-клетка химерного антигенного рецептора - Chimeric antigen receptor T cell
Т-клетки химерного антигенного рецептора (также известные как Т-клетки CAR ) - это Т-клетки , которые были генетически сконструированы для производства искусственного Т-клеточного рецептора для использования в иммунотерапии .
Химерные антигенные рецепторы ( CAR , также известные как химерные иммунорецепторы , химерные Т-клеточные рецепторы или искусственные Т-клеточные рецепторы ) представляют собой рецепторные белки, которые были созданы, чтобы дать Т-клеткам новую способность нацеливаться на конкретный белок . Рецепторы являются химерными, поскольку они объединяют в себе функции связывания антигена и активации Т-клеток в одном рецепторе.
CAR-T- клеточная терапия использует T-клетки, сконструированные с CAR для лечения рака. Предпосылка иммунотерапии CAR-T состоит в том, чтобы модифицировать Т-клетки для распознавания раковых клеток с целью более эффективного нацеливания и уничтожения их. Ученые собирают Т-клетки у людей, генетически изменяют их, а затем вводят полученные CAR-Т-клетки пациентам, чтобы атаковать их опухоли. CAR-T-клетки могут происходить либо из Т-клеток собственной крови пациента ( аутологичные ), либо из Т-клеток другого здорового донора ( аллогенные ). После выделения от человека эти Т-клетки генетически сконструированы для экспрессии определенного CAR, который программирует их нацеливание на антиген, присутствующий на поверхности опухолей. В целях безопасности CAR-T-клетки сконструированы так, чтобы быть специфичными к антигену, экспрессирующемуся на опухоли, который не экспрессируется на здоровых клетках.
После того, как CAR-T-клетки вводятся пациенту, они действуют как «живое лекарство» против раковых клеток. Когда они вступают в контакт со своим целевым антигеном на клетке, клетки CAR-T связываются с ним и активируются, а затем продолжают пролиферировать и становятся цитотоксическими . CAR-T-клетки разрушают клетки с помощью нескольких механизмов, включая обширную стимулированную пролиферацию клеток, повышение степени их токсичности для других живых клеток (цитотоксичность) и увеличение секреции факторов, которые могут влиять на другие клетки, таких как цитокины , интерлейкины и т. Д. факторы роста.
Производство
Первым шагом в производстве CAR-T-клеток является выделение T-клеток из крови человека. CAR-T-клетки могут быть произведены либо из собственной крови пациента, известной как аутологичное лечение, либо из крови здорового донора, известного как аллогенное лечение. В обоих случаях производственный процесс одинаков; отличается только выбор первоначального донора крови.
Сначала лейкоциты выделяют с помощью сепаратора клеток крови в процессе, известном как лейкоцитарный аферез . Затем отделяют и собирают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC). Затем продукты лейкоцитарного афереза переносятся в центр обработки клеток. В центре обработки клеток стимулируются специфические Т-клетки, так что они активно размножаются и увеличиваются в размерах. Чтобы стимулировать их рост, Т-клетки обычно обрабатывают цитокиновым интерлейкином 2 (ИЛ-2) и антителами к CD3 .
Разросшиеся Т-клетки очищают и затем трансдуцируют геном, кодирующим сконструированный CAR, с помощью ретровирусного вектора , обычно либо интегрирующего гаммаретровирусного (RV), либо лентивирусного (LV) вектора. Эти векторы очень безопасны в наше время из-за частичного удаления области U3. Новый инструмент редактирования генов CRISPR / Cas9 недавно был использован вместо ретровирусных векторов для интеграции гена CAR в определенные участки генома.
Перед введением сконструированных CAR-T-клеток пациент проходит курс химиотерапии лимфодеплеции . Истощение количества циркулирующих лейкоцитов у пациента стимулирует количество продуцируемых цитокинов и снижает конкуренцию за ресурсы, что способствует увеличению количества сконструированных CAR-T-клеток.
Лечение рака
1. Т-клетки (представленные объектами, обозначенными буквой «t») удаляются из крови пациента.
2. Затем в лабораторных условиях ген, кодирующий специфические рецепторы антигена, внедряется в Т-клетки.
3. Таким образом продуцируя рецепторы CAR (обозначенные как c) на поверхности клеток.
4. Затем вновь модифицированные Т-клетки собирают и выращивают в лаборатории.
5. По истечении определенного периода времени сконструированные Т-клетки снова вводятся пациенту.
Т-клетки генетически сконструированы для экспрессии химерных антигенных рецепторов, специально направленных против антигенов на опухолевых клетках пациента, а затем вливаются пациенту, где они атакуют и убивают раковые клетки. Адоптивный перенос Т-клеток, экспрессирующих CAR, является многообещающим противораковым терапевтическим средством, поскольку Т-клетки, модифицированные с помощью CAR, могут быть сконструированы для нацеливания практически на любой антиген, связанный с опухолью .
Ранние исследования CAR-T-клеток были сосредоточены на раке крови . Первые одобренные методы лечения используют CAR, которые нацелены на антиген CD19 , присутствующий при B-клеточном раке, таком как острый лимфобластный лейкоз (ALL) и диффузная крупноклеточная B-клеточная лимфома (DLBCL). Также прилагаются усилия по созданию CAR, нацеленных на многие другие антигены рака крови, включая CD30 при резистентной лимфоме Ходжкина ; CD33 , CD123 и FLT3 при остром миелоидном лейкозе (AML); и BCMA при множественной миеломе .
Солидные опухоли представляют собой более сложную мишень. Идентификация хороших антигенов была сложной задачей: такие антигены должны сильно экспрессироваться на большинстве раковых клеток, но в значительной степени отсутствовать в нормальных тканях. CAR-T-клетки также не переносятся эффективно в центр солидных опухолевых масс, а враждебное опухолевое микроокружение подавляет активность Т-клеток.
Клинические исследования и одобрения FDA
Первые два препарата CAR-T, одобренные FDA, нацелены на антиген CD19 , который обнаруживается при многих типах В-клеточного рака. Tisagenlecleucel (Kymriah / Novartis ) одобрен для лечения рецидивирующей / рефрактерной B-клеточной предшественницы острого лимфобластного лейкоза (ALL), а axicabtagene ciloleucel (Yescarta / Kite Pharma ) одобрен для лечения рецидивирующей / рефрактерной диффузной большой B-клеточной лимфомы (DLBC).
По состоянию на март 2019 года во всем мире проводилось около 364 клинических испытаний с участием CAR-T-клеток. Большинство этих исследований нацелены на рак крови: на лечение CAR-T приходится более половины всех исследований гематологических злокачественных новообразований. CD19 продолжает оставаться наиболее популярной мишенью для антигена, за ним следует ВСМА (обычно экспрессируется при множественной миеломе ). В 2016 году начались исследования по изучению жизнеспособности других антигенов, таких как CD20. В исследованиях солидных опухолей в меньшей степени доминирует CAR-T, при этом около половины исследований, основанных на клеточной терапии, включают другие платформы, такие как NK-клетки .
Хотя исходная частота клинических ремиссий после терапии CAR-T-клетками у всех пациентов достигает 90%, показатели долгосрочной выживаемости намного ниже. Причиной обычно является появление лейкозных клеток, которые не экспрессируют CD19 и поэтому ускользают от распознавания CD19-CAR Т-клетками, явление, известное как ускользание антигена . Доклинические исследования по разработке CAR-T-клеток с двойным нацеливанием на CD19 плюс CD22 или CD19 плюс CD20 продемонстрировали многообещающие результаты, и испытания, изучающие биспецифическое нацеливание для обхода подавления CD19, продолжаются.
Соображения безопасности
Внесение CAR-T-клеток в организм вызывает серьезные побочные эффекты, включая синдром высвобождения цитокинов и неврологическую токсичность. Поскольку это относительно новый метод лечения, имеется мало данных о долгосрочных эффектах терапии CAR-T-клетками. По-прежнему существуют опасения по поводу долгосрочного выживания пациентов, а также по поводу осложнений беременности у пациенток, получавших CAR-T-клетки.
Наиболее частой проблемой после лечения CAR-T-клетками является синдром высвобождения цитокинов (CRS), состояние, при котором иммунная система активируется и высвобождает повышенное количество воспалительных цитокинов . Клиническое проявление этого синдрома напоминает сепсис с высокой температурой, утомляемостью, миалгией , тошнотой, утечкой капилляров, тахикардией и другими нарушениями функции сердца, печеночной недостаточностью и почечной недостаточностью. CRS встречается почти у всех пациентов, получавших терапию CAR-T-клетками; Фактически, наличие CRS является диагностическим маркером, который указывает на то, что клетки CAR-T работают так, как предназначены для уничтожения раковых клеток. Обратите внимание, однако, что более высокая степень тяжести СВК коррелирует не с повышенным ответом на лечение, а с более высоким бременем заболевания.
Неврологическая токсичность также часто связана с лечением CAR-T-клетками. Основной механизм плохо изучен и может быть связан или не связан с CRS. Клинические проявления включают делирий, частичную потерю способности связно говорить при сохранении способности интерпретировать язык ( экспрессивная афазия ), снижение внимания ( притупление сознания ) и судороги. Во время некоторых клинических испытаний имели место случаи смерти из-за нейротоксичности. Основная причина смерти от нейротоксичности - отек мозга . В исследовании, проведенном Juno Therapeutics , Inc., пять пациентов, участвовавших в исследовании, умерли в результате отека мозга. Двое из пациентов лечились одним циклофосфамидом, а остальные трое лечились комбинацией циклофосфамида и флударабина . В другом клиническом исследовании, спонсируемом Исследовательским центром рака Фреда Хатчинсона , был зарегистрирован один случай необратимой и фатальной неврологической токсичности через 122 дня после введения CAR-T-клеток.
Анафилаксия - это ожидаемый побочный эффект, поскольку CAR производится с использованием чужеродных моноклональных антител и, как следствие, вызывает иммунный ответ.
Распознавание на мишени / вне опухоли происходит, когда CAR-T-клетка распознает правильный антиген , но антиген экспрессируется в здоровой непатогенной ткани. Это приводит к тому, что CAR-T-клетки атакуют неопухолевые ткани, такие как здоровые В-клетки, экспрессирующие CD19. Тяжесть этого побочного эффекта может варьироваться от аплазии В-клеток , которую можно лечить поддерживающими инфузиями, до крайней токсичности, ведущей к смерти.
Также существует маловероятная вероятность того, что сконструированные клетки CAR-T сами превратятся в раковые клетки посредством инсерционного мутагенеза из-за того, что вирусный вектор вставляет ген CAR в супрессор опухоли или онкоген в геноме Т-клетки-хозяина. Некоторые ретровирусные (RV) векторы несут меньший риск, чем лентивирусные (LV) векторы. Однако оба они могут быть онкогенными. Анализ геномного секвенирования сайтов встраивания CAR в Т-клетки был разработан для лучшего понимания функции и персистенции CAR T-клеток in vivo.
Рецепторная структура
Химерные антигенные рецепторы объединяют многие аспекты нормальной активации Т-клеток в один белок. Они связывают внеклеточный домен распознавания антигена с внутриклеточным сигнальным доменом, который активирует Т-клетку, когда антиген связывается. CAR состоят из четырех областей: домена распознавания антигена, внеклеточной шарнирной области, трансмембранного домена и внутриклеточного сигнального домена Т-клеток.
Домен распознавания антигена
Домен распознавания антигена экспонируется снаружи клетки в эктодоменной части рецептора. Он взаимодействует с потенциальными молекулами-мишенями и отвечает за нацеливание CAR-T-клетки на любую клетку, экспрессирующую подходящую молекулу.
Домен распознавания антигена обычно происходит из вариабельных областей моноклонального антитела, связанных вместе как одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). ScFv представляет собой химерный белок, состоящий из легкой (V L ) и тяжелой (V H ) цепей иммуноглобинов , связанных с коротким линкерным пептидом. Эти области V L и V H выбираются заранее по их способности связываться с антигеном-мишенью (таким как CD19). Линкер между двумя цепями состоит из гидрофильных остатков с участками глицина и серина в нем для гибкости, а также участками глутамата и лизина для дополнительной растворимости. Однодоменные антитела (например, V H , V H H) были сконструированы и разработаны как домены распознавания антигена в формате CAR из-за их высокой эффективности трансдукции в Т-клетки.
В дополнение к фрагментам антител, подходы, не основанные на антителах, также использовались для управления специфичностью CAR, обычно с использованием пар лиганд / рецептор, которые обычно связываются друг с другом. Цитокины, рецепторы врожденного иммунитета, рецепторы TNF, факторы роста и структурные белки были успешно использованы в качестве доменов распознавания антигена CAR.
Шарнирная область
Шарнир, также называемый спейсером, представляет собой небольшой структурный домен, который находится между областью распознавания антигена и внешней мембраной клетки. Идеальный шарнир увеличивает гибкость головки рецептора scFv, уменьшая пространственные ограничения между CAR и его антигеном-мишенью. Это способствует связыванию антигена и образованию синапсов между CAR-T-клетками и клетками-мишенями. Шарнирные последовательности часто основаны на проксимальных к мембране областях других иммунных молекул, включая IgG , CD8 и CD28 .
Трансмембранный домен
Трансмембранный домен является структурным компонентом, состоящий из гидрофобного альфа - спирали , которая охватывает клеточную мембрану. Он прикрепляет CAR к плазматической мембране, соединяя внеклеточный шарнир и домены распознавания антигена с внутриклеточной сигнальной областью. Этот домен важен для стабильности рецептора в целом. Обычно используется трансмембранный домен из наиболее проксимального к мембране компонента эндодомена, но разные трансмембранные домены приводят к разной стабильности рецептора. CD28 трансмембранный домен , как известно, приводит к высоко стабильной, выраженной рецептора.
Использование трансмембранного домена CD3-дзета не рекомендуется, так как это может привести к включению искусственного TCR в нативный TCR.
Внутриклеточный сигнальный домен Т-клеток
Внутриклеточный сигнальный домен Т-клеток находится в эндодомене рецептора внутри клетки. После связывания антигена с внешним доменом распознавания антигена рецепторы CAR объединяются в кластеры и передают сигнал активации. Затем внутренний цитоплазматический конец рецептора поддерживает передачу сигналов внутри Т-клетки.
Нормальная активация Т-клеток зависит от фосфорилирования иммунорецепторных тирозиновых мотивов активации (ITAM), присутствующих в цитоплазматическом домене CD3-дзета . Чтобы имитировать этот процесс, цитоплазматический домен CD3-zeta обычно используется в качестве основного компонента эндодомена CAR. Были опробованы и другие домены, содержащие ITAM, но они не так эффективны.
Т-клеткам также необходимы костимулирующие молекулы в дополнение к передаче сигналов CD3, чтобы они сохранялись после активации. По этой причине эндодомены рецепторов CAR обычно также включают один или несколько химерных доменов костимулирующих белков. Сигнальные домены из широкого спектра костимулирующих молекул были успешно протестированы, включая CD28 , CD27 , CD134 (OX40) и CD137 (4-1BB) .
Эволюция дизайна автомобилей
Первые клетки CAR-T были разработаны в 1987 г. Йошиказу Кувана и соавт. за ним в 1989 г. последовали Гидеон Гросс и Зелиг Эшхар из Института Вейцмана , Израиль. Сложность сконструированных рецепторов CAR со временем выросла, и в зависимости от их состава их называют CAR первого, второго, третьего или четвертого поколения.
CAR первого поколения состоят из внеклеточного связывающего домена, шарнирной области, трансмембранного домена и одного или нескольких внутриклеточных сигнальных доменов. Внеклеточный связывающий домен содержит одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), полученный из опухолевых антиген-реактивных антител, который обычно имеет высокую специфичность к определенному опухолевому антигену. Все CAR содержат домен цепи CD3ζ в качестве внутриклеточного сигнального домена, который является первичным передатчиком сигналов активации Т-клеток.
CAR второго поколения добавляют костимулирующий домен, например CD28 или 4-1BB. Участие этих внутриклеточных сигнальных доменов улучшает пролиферацию Т-клеток, секрецию цитокинов, устойчивость к апоптозу и устойчивость in vivo.
CAR третьего поколения объединяют несколько костимулирующих доменов, таких как CD28-41BB или CD28-OX40, для увеличения активности Т-клеток. Доклинические данные показывают, что CAR третьего поколения демонстрируют улучшенные эффекторные функции и лучшую устойчивость in vivo по сравнению с CAR второго поколения.
CAR четвертого поколения (также известные как TRUCK или бронированные CAR) дополнительно добавляют факторы, которые увеличивают экспансию, устойчивость и противоопухолевую активность Т-клеток. Это может включать цитокины, такие как IL-2 , IL-5 , IL-12 и костимулирующие лиганды.
в 2018 году была разработана версия CAR, получившая название SUPRA CAR, или разделенная, универсальная и программируемая. Можно использовать несколько механизмов для точного регулирования активности SUPRA CAR, что ограничивает чрезмерную активацию. В отличие от традиционной конструкции CAR, SUPRA CAR позволяет нацеливать множество антигенов без дальнейшей генетической модификации иммунных клеток человека.
Механизмы управления
Добавление синтетического механизма контроля к сконструированным Т-клеткам позволяет врачам точно контролировать устойчивость или активность Т-клеток в организме пациента с целью снижения токсических побочных эффектов. Основные методы контроля вызывают гибель Т-клеток или ограничивают активацию Т-клеток и часто регулируют Т-клетки с помощью отдельного лекарства, которое можно вводить или отменять по мере необходимости.
Гены-самоубийцы: Генетически модифицированные Т-клетки сконструированы таким образом, чтобы включать один или несколько генов, которые могут вызывать апоптоз при активации внеклеточной молекулой. Вирус простого герпеса тимидинкиназы (ВПГ-ТЗ) и индуцируемый каспазы 9 (iCasp9) два типа генов самоубийства , которые были интегрированы в CAR-Т - клеток. В системе iCasp9 комплекс суицидных генов состоит из двух элементов: мутировавшего FK506-связывающего белка с высокой специфичностью к небольшой молекуле римидуцида / AP1903 и гена, кодирующего человеческую каспазу 9 с удаленным продоменом. Дозировка римидуцида пациенту активирует его. система самоубийства, ведущая к быстрому апоптозу генетически модифицированных Т-клеток. Хотя обе системы HSV-TK и iCasp9 демонстрируют заметную функцию предохранительного выключателя в клинических испытаниях, некоторые недостатки ограничивают их применение. HSV-TK происходит от вируса и может быть иммуногенным для человека. Также в настоящее время неясно, будут ли стратегии суицидных генов действовать достаточно быстро во всех ситуациях, чтобы остановить опасную цитотоксичность вне опухоли.
Рецептор двойного антигена: CAR-T-клетки сконструированы для одновременной экспрессии двух связанных с опухолью антигенных рецепторов, что снижает вероятность того, что Т-клетки будут атаковать неопухолевые клетки. Сообщалось, что клетки CAR-T с двойным антигеном имеют менее выраженные побочные эффекты. Исследование in vivo на мышах показывает, что клетки с двойным рецептором CAR-T эффективно исключают рак простаты и обеспечивают полное долгосрочное выживание.
Переключатель ВКЛ: в этой системе CAR-T-клетки могут функционировать только в присутствии как опухолевого антигена, так и доброкачественной экзогенной молекулы. Чтобы достичь этого, сконструированный рецептор химерного антигена CAR-T-клетки разделяется на два отдельных белка, которые должны объединиться, чтобы функционировать. Первый рецепторный белок обычно содержит внеклеточный антигенсвязывающий домен, тогда как второй белок содержит нижерасположенные сигнальные элементы и костимуляторные молекулы (такие как CD3ζ и 4-1BB). В присутствии экзогенной молекулы (такой как аналог рапамицина) связывающий и сигнальный белки димеризуются вместе, позволяя CAR-T-клеткам атаковать опухоль.
Биспецифические молекулы как переключатели: биспецифические молекулы нацелены как на ассоциированный с опухолью антиген, так и на молекулу CD3 на поверхности Т-клеток. Это гарантирует, что Т-клетки не могут активироваться, если они не находятся в непосредственной близости от опухолевой клетки. Биспецифическая молекула против CD20 / CD3 проявляет высокую специфичность как к злокачественным В-клеткам, так и к раковым клеткам мышей. FITC - еще одна бифункциональная молекула, используемая в этой стратегии. FITC может перенаправлять и регулировать активность FITC- специфических клеток CAR-T в отношении опухолевых клеток с рецепторами фолиевой кислоты.
Технология адаптера конъюгатов малых молекул лекарственных средств
Платформа SMDC (низкомолекулярные конъюгаты лекарственных средств) в иммуноонкологии - это экспериментальный подход, который делает возможным создание единой универсальной CAR Т-клетки, которая связывается с чрезвычайно высоким сродством с доброкачественной молекулой, обозначенной как флуоресцеинизотиоцианат (FITC). Затем эти клетки используются для лечения различных типов рака при совместном введении с биспецифическими адапторными молекулами SMDC. Эти уникальные биспецифические адаптеры сконструированы из молекулы FITC и молекулы, возвращающей опухоль, для точного соединения универсальной CAR Т-клетки с раковыми клетками, что вызывает локальную активацию Т-клеток. Противоопухолевая активность у мышей индуцируется только тогда, когда присутствуют как универсальные Т-клетки CAR, так и правильные антиген-специфические адаптерные молекулы. Противоопухолевую активность и токсичность можно контролировать, регулируя дозировку вводимой адапторной молекулы. Лечение антигенно-гетерогенных опухолей может быть достигнуто путем введения смеси желаемых антиген-специфических адаптеров.
Существуют несколько проблем, с которыми сталкиваются современные методы лечения CAR Т-клетками, такие как:
- невозможность контролировать скорость высвобождения цитокинов и лизис опухоли
- отсутствие выключателя, который прекратил бы цитотоксическую активность после завершения ликвидации опухоли
- потребность в создании различных CAR T-клеток для каждого уникального опухолевого антигена может быть решена или смягчена с помощью адаптивного подхода.