Активация транскрипции, контролируемая тетрациклином - Tetracycline-controlled transcriptional activation
Активация транскрипции, контролируемая тетрациклином, представляет собой метод индуцибельной экспрессии генов, при котором транскрипция обратимо включается или выключается в присутствии антибиотика тетрациклина или одного из его производных (например, доксициклина ).
Экспрессия гена, контролируемая тетрациклином, основана на механизме устойчивости к лечению тетрациклиновыми антибиотиками, обнаруженного у грамотрицательных бактерий . В природе промотор P tet экспрессирует TetR, репрессор , и TetA, белок, который выкачивает тетрациклиновый антибиотик из клетки.
Разница между Tet-On и Tet-Off не в том, включает или выключает трансактиватор ген, как следует из названия; скорее, оба белка активируют экспрессию. Разница связана с их соответствующей реакцией на тетрациклин или доксициклин (Dox, более стабильный аналог тетрациклина); Tet-Off активирует экспрессию в отсутствие Dox, тогда как Tet-On активируется в присутствии Dox.
Тет-офф и Тет-он
Две наиболее часто используемые индуцибельные системы экспрессии для исследования биологии эукариотических клеток называются Tet-Off и Tet-On. Система Tet-Off для контроля экспрессии генов , представляющих интерес в клетках млекопитающих был разработан профессорами Герман Bujard и Манфред Госсен в Гейдельбергском университете и впервые опубликован в 1992 году.
В системе Tet-Off используется белок- трансактиватор тетрациклина (tTA) , который создается путем слияния одного белка , TetR (репрессор тетрациклина), обнаруженного в бактериях Escherichia coli , с доменом активации другого белка, VP16 , обнаруженного при герпесе. симплекс-вирус .
Полученный в результате белок tTA способен связываться с ДНК в определенных последовательностях оператора TetO . В большинстве систем Tet-Off несколько повторов таких последовательностей TetO размещаются выше минимального промотора, такого как промотор CMV . Совокупность нескольких последовательностей TetO с минимальным промотором называется элементом ответа на тетрациклин (TRE), потому что он реагирует на связывание белка трансактиватора тетрациклина tTA повышенной экспрессией гена или генов ниже его промотора.
В системе Tet-Off экспрессия TRE-контролируемых генов может подавляться тетрациклином и его производными. Они связывают tTA и делают его неспособным связываться с последовательностями TRE, тем самым предотвращая трансактивацию TRE-контролируемых генов.
Система Tet-On работает аналогично, но наоборот. В то время как в системе Tet-Off, tTA способен связывать оператора, только если он не связан с тетрациклином или одним из его производных, таким как доксициклин, в системе Tet-On белок rtTA способен связывать оператора, только если он связан тетрациклином. Таким образом, введение доксициклина в систему инициирует транскрипцию генетического продукта. Систему Tet-On иногда предпочитают Tet-Off из-за ее более быстрого реагирования.
Системы экспрессии Tet-Off также используются для создания трансгенных мышей, которые условно экспрессируют интересующий ген.
Tet-On Advanced и Tet-On 3G
Трансактиватор Tet-On Advanced (также известный как rtTA2 S -M2) представляет собой альтернативную версию Tet-On, которая демонстрирует пониженную базальную экспрессию и функционирует при концентрации Dox в 10 раз ниже, чем Tet-Off. Кроме того, его экспрессия считается более стабильной в эукариотических клетках из-за того, что он оптимизирован для кодонов человека и использует три минимальных домена активации транскрипции. Он был открыт в 2000 году как один из двух улучшенных мутантов Х. Бухардом и его коллегами после случайного мутагенеза репрессорной части Tet гена трансактиватора. Tet-On 3G (также известный как rtTA-V10) похож на Tet-On Advanced, но произошел от rtTA2 S -S2, а не от rtTA2 S -M2. Он также оптимизирован по кодонам человека и состоит из трех минимальных доменов активации VP16. Однако белок Tet-On 3G имеет пять аминокислотных отличий по сравнению с Tet-On Advanced, что, по-видимому, еще больше увеличивает его чувствительность к Dox. Tet-On 3G чувствителен к Dox в 100 раз меньше и в семь раз активнее, чем исходный Tet-On.
Другие системы
Другие системы, такие как система T-REx от Life Technologies, работают иначе. Интересующий ген фланкирован вышестоящим промотором CMV и двумя сайтами TetO2. Экспрессия интересующего гена подавляется за счет высокого сродства связывания гомодимеров TetR с каждой последовательностью TetO2 в отсутствие тетрациклина. Введение тетрациклина приводит к связыванию одного тетрациклина с каждым гомодимером TetR с последующим высвобождением TetO2 гомодимерами TetR. Несвязывание гомодимеров TetR и TetO2 приводит к дерепрессии интересующего гена.
Модифицированная версия T-REx - это синтетическая биологическая схема линеаризатора , оптимизированная для настройки экспрессии генов в эукариотических (почкующихся дрожжах, человеческих и т. Д.) Клетках. Путем включения сайтов TetO2 в промотор, управляющий экспрессией TetR, он создает отрицательную обратную связь , которая обеспечивает однородную экспрессию (низкий уровень шума) и линейную реакцию на дозу для аналогов тетрациклина.
Элемент ответа на тетрациклин (TRE)
В наиболее часто используемых плазмидах элемент ответа на тетрациклин состоит из семи повторов бактериальной последовательности TetO длиной 19 п.о. (TCCCTATCAGTGATAGAGA), разделенных последовательностями спейсера (например: ACGATGTCGAGTTTAC). Именно TetO распознается и связывается частью TetR Tet-On или Tet-Off. TRE обычно размещается выше минимального промотора, который имеет очень низкую базальную экспрессию в отсутствие связанного Tet-Off (или Tet-On).
Преимущества и недостатки
Система Tet имеет преимущества перед системами условной экспрессии генов Cre , FRT и ER (рецептор эстрогена). В системах Cre и FRT активация или нокаут гена необратимы после завершения рекомбинации, тогда как в системах Tet и ER это обратимо. Система Tet очень жестко контролирует экспрессию, тогда как система ER несколько негерметична. Однако система Tet, которая зависит от транскрипции и последующей трансляции целевого гена, не так быстро действует, как ER-система, которая стабилизирует уже экспрессированный целевой белок при введении гормона. Кроме того, поскольку последовательность tet-o длиной 19 пар оснований в природе отсутствует в клетках млекопитающих, считается, что плейотропия минимизирована по сравнению с гормональными методами контроля. При использовании системы Tet в культуре клеток важно подтвердить, что каждая партия фетальной бычьей сыворотки тестируется, чтобы подтвердить, что контаминирующие тетрациклины отсутствуют или их слишком мало, чтобы препятствовать индуцибельности.
Механизм действия антибактериального эффекта тетрациклинов основан на нарушении трансляции белков в бактериях, тем самым нарушая способность микробов расти и восстанавливаться; однако трансляция белка также нарушается в митохондриях эукариот, что приводит к эффектам, которые могут искажать экспериментальные результаты.