SDS-PAGE - SDS-PAGE
SDS-PAGE ( электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия ) - это прерывистая электрофоретическая система, разработанная Ульрихом К. Лэммли, которая обычно используется в качестве метода разделения белков с молекулярной массой от 5 до 250 кДа . Совместное использование додецилсульфата натрия (SDS, также известного как лаурилсульфат натрия) и полиакриламидного геля позволяет исключить влияние структуры и заряда, а белки разделяются исключительно на основе различий в их молекулярной массе.
Характеристики
SDS-PAGE - это метод электрофореза, который позволяет разделить белок по массе. Среда (также называемая «матрицей») представляет собой прерывистый гель на основе полиакриламида. Полиакриламидный гель обычно помещается между двумя стеклянными пластинами в пластинчатом геле . Хотя гели в трубках (в стеклянных цилиндрах) использовались исторически, они быстро устарели с изобретением более удобных плоских гелей. Кроме того, используется SDS ( додецилсульфат натрия ). Около 1,4 грамма SDS связываются с граммом белка, что соответствует одной молекуле SDS на две аминокислоты . SDS действует как поверхностно-активное вещество , маскируя внутренний заряд белков и придавая им очень похожие отношения заряда к массе. Собственные заряды белков пренебрежимо малы по сравнению с загрузкой SDS, а положительные заряды также значительно уменьшаются в основном диапазоне pH разделяющего геля. При приложении постоянного электрического поля белок перемещается к аноду, каждый с разной скоростью, в зависимости от его массы. Эта простая процедура позволяет точно разделить белок по массе.
SDS имеет тенденцию к образованию сферических мицелл в водных растворах с концентрацией выше определенной, называемой критической мицеллярной концентрацией (CMC). Выше критической мицеллярной концентрации от 7 до 10 миллимолей в растворах SDS одновременно встречается как отдельные молекулы ( мономер ) и как мицеллы, ниже CMC SDS встречается только как мономеры в водных растворах. При критической концентрации мицелл мицелла состоит примерно из 62 молекул SDS. Однако только мономеры SDS связываются с белками посредством гидрофобных взаимодействий, тогда как мицеллы SDS являются анионными снаружи и не адсорбируют какой-либо белок. SDS является амфипатическим по своей природе, что позволяет ему раскрывать как полярные, так и неполярные участки структуры белка. При концентрациях SDS выше 0,1 миллимоля начинается развертывание белков, а при концентрациях выше 1 мМ большинство белков денатурируются. Из-за сильного денатурирующего эффекта SDS и последующей диссоциации белковых комплексов четвертичные структуры, как правило, не могут быть определены с помощью SDS. Исключение составляют белки, которые стабилизируются ковалентным сшиванием, например -SS- связями, и устойчивые к SDS белковые комплексы, которые стабильны даже в присутствии SDS (последний, однако, только при комнатной температуре). Для денатурирования устойчивых к SDS комплексов требуется высокая энергия активации, которая достигается за счет нагревания. Устойчивость к SDS основана на метастабильности белковой складки. Хотя нативный, полностью свернутый, устойчивый к SDS белок не обладает достаточной стабильностью в присутствии SDS, химическое равновесие денатурации при комнатной температуре происходит медленно. Стабильные белковые комплексы характеризуются не только устойчивостью к SDS, но также устойчивостью к протеазам и увеличенным биологическим периодом полужизни .
Альтернативно, электрофорез в полиакриламидном геле также можно проводить с катионными поверхностно-активными веществами CTAB в CTAB-PAGE или 16-BAC в BAC-PAGE.
Процедура
Метод SDS-PAGE состоит из приготовления геля, пробоподготовки, электрофореза, окрашивания белков или вестерн-блоттинга и анализа полученного рисунка полос.
Производство гелей
При использовании различных буферов в геле (прерывистый гель-электрофорез) гели готовят за один день до электрофореза, чтобы диффузия не приводила к смешиванию буферов. Гель получают радикальной полимеризацией в форме, состоящей из двух герметичных стеклянных пластин с прокладками между стеклянными пластинами. В типичной настройке мини-геля прокладки имеют толщину 0,75 мм или 1,5 мм, что определяет несущую способность геля. Для заливки гелевого раствора пластины обычно зажимают на подставке, которая временно закрывает открытую в противном случае нижнюю сторону стеклянных пластин двумя прокладками. Для гелевого раствора смешивают акриламид в качестве гелеобразователя (обычно 4% об. / Об. В геле для укладки и 10–12% в разделяющем геле), метиленбисакриламид в качестве сшивающего агента, буфер для накопления или разделения геля, воду и SDS. . При добавлении катализатора ТЕМЕД и радикального инициатора персульфата аммония (APS) начинается полимеризация. Затем раствор заливается между стеклянными пластинами, не образуя пузырей. В зависимости от количества катализатора и радикального стартера и в зависимости от температуры полимеризация длится от четверти часа до нескольких часов. Сначала наливают нижний гель (разделяющий гель) и покрывают несколькими каплями труднорастворимого в воде спирта (обычно насыщенного буфером бутанола или изопропанола), который удаляет пузырьки из мениска и защищает гелевый раствор акцептора радикалов кислорода. После полимеризации разделяющего геля спирт удаляют, а остаточный спирт удаляют фильтровальной бумагой . После добавления APS и TEMED к раствору накопительного геля его выливают поверх твердого разделительного геля. После этого между стеклянными пластинами вставляется подходящая гребенка для образцов без образования пузырей. Гребень для образца осторожно вынимают после полимеризации, оставляя карманы для нанесения образца. Для последующего использования белков для секвенирования белков гели часто готовят за день до электрофореза, чтобы уменьшить реакции неполимеризованного акриламида с цистеинами в белках.
Используя градиентный смеситель , можно отливать градиентные гели с градиентом акриламида (обычно от 4 до 12%), которые имеют больший диапазон разделения молекулярных масс. В коммерческих гелевых системах (так называемые предварительно отлитые гели ) обычно используется буферное вещество бис-трис-метан со значением pH от 6,4 до 7,2 как в геле для укладки, так и в геле для разделения. Эти гели поставляются литыми и готовыми к использованию. Поскольку они используют только один буфер ( непрерывный гель-электрофорез ) и имеют почти нейтральный pH, их можно хранить в течение нескольких недель. Более нейтральный pH замедляет гидролиз и, следовательно, разложение полиакриламида. Кроме того, в белках содержится меньше цистеинов, модифицированных акриламидом. Благодаря постоянному pH в собирающем и разделяющем геле эффект складывания отсутствует. Белки в гелях Бистрис не окрашиваются комплексами рутения. Эта гелевая система имеет сравнительно большой диапазон разделения, который можно варьировать, используя MES или MOPS в рабочем буфере.
Базовые приготовления
Во время подготовки образца к белкам в избытке добавляют буфер для образца и, следовательно, SDS, и затем образец нагревают до 95 ° C в течение пяти минут или, альтернативно, до 70 ° C в течение десяти минут. Нагревание разрушает вторичные и третичные структуры белка, разрывая водородные связи и растягивая молекулы. Необязательно, дисульфидные мостики можно расщепить восстановлением. Для этого в буфер для образца добавляют восстанавливающие тиолы, такие как β-меркаптоэтанол (β-ME, 5% по объему), дитиотреитол (DTT, 10 ммоль) или дитиоэритрит (DTE, 10 ммоль). После охлаждения до комнатной температуры каждый образец пипеткой переносят в свою лунку в геле, который предварительно был погружен в буфер для электрофореза в аппарате для электрофореза.
В дополнение к образцам на гель обычно наносят маркер размера молекулярной массы . Он состоит из белков известных размеров и, таким образом, позволяет оценить (с ошибкой ± 10%) размеры белков в реальных образцах, которые мигрируют параллельно по разным дорожкам геля. Маркер размера часто вводится пипеткой в первый или последний карман геля.
Электрофорез
Для разделения денатурированные образцы наносят на гель из полиакриламида, который помещают в буфер для электрофореза с подходящими электролитами. После этого прикладывается напряжение (обычно около 100 В, 10-20 В на см длины геля), которое вызывает миграцию отрицательно заряженных молекул через гель в направлении положительно заряженного анода . Гель действует как сито. Небольшие белки относительно легко мигрируют через сетку геля, тогда как более крупные белки с большей вероятностью удерживаются и, таким образом, более медленно мигрируют через гель, что позволяет разделить белки по размеру молекул. Электрофорез длится от получаса до нескольких часов в зависимости от напряжения и длины используемого геля.
Наиболее быстро мигрирующие белки (с молекулярной массой менее 5 кДа) образуют буферный фронт вместе с анионными компонентами буфера для электрофореза, которые также мигрируют через гель. Область передней части буфера становится видимой путем добавления в буфер для образца сравнительно небольшого количества анионного красителя бромфенолового синего . Из-за относительно небольшого размера молекулы бромфенолового синего он мигрирует быстрее, чем белки. Путем оптического контроля мигрирующей цветной полосы можно остановить электрофорез до того, как краситель полностью пройдет через гель и покинет его.
Наиболее часто используемый метод - это прерывистый SDS-PAGE. В этом методе белки сначала мигрируют в собирающий гель с нейтральным pH, в котором они концентрируются, а затем они мигрируют в разделяющий гель с основным pH, в котором и происходит фактическое разделение. Укладка и разделение гелей различаются разным размером пор (4-6% T и 10-20% T), ионной силой и значениями pH (pH 6,8 или pH 8,8). Электролит наиболее часто используемый является SDS-содержащих Трис - глицин - хлорид буфера системы. При нейтральном pH глицин преимущественно образует цвиттерионную форму, при высоком pH глицины теряют положительные заряды и становятся преимущественно анионными. В собирающем геле меньшие, отрицательно заряженные ионы хлорида мигрируют перед белками (как ведущие ионы), а несколько более крупные, отрицательно и частично положительно заряженные ионы глицината мигрируют за белками (как начальные замыкающие ионы), тогда как в сравнительно основной разделяющий гель: оба иона мигрируют перед белками. Градиент pH между буферами накопительного геля и разделительного геля приводит к эффекту накопления на границе накопительного геля с разделительным гелем, поскольку глицинат частично теряет свои замедляющие положительные заряды по мере увеличения pH, а затем, как бывший замыкающий ион, обгоняет белков и становится ведущим ионом, из-за чего полосы различных белков (видимые после окрашивания) становятся более узкими и резкими - эффект наложения. Для разделения небольших белков и пептидов, трис- Трицин буфер системы Schägger и фон Ягов используется в связи с более высоким распространением белков в диапазоне от 0,5 до 50 кДа.
Окрашивание гелем
В конце электрофоретического разделения все белки сортируются по размеру и затем могут быть проанализированы другими методами, например окрашиванием белков, таким как окрашивание Кумасси (наиболее распространенное и простое в использовании), окрашивание серебром (самая высокая чувствительность), окрашивает все окрашивание, Окрашивание амидо черным 10B , быстрое окрашивание FCF зеленым , флуоресцентные окрашивания, такие как окрашивание эпикоккононом и окрашивание оранжевым SYPRO, а также иммунологическое обнаружение, такое как вестерн-блоттинг . Флуоресцентные красители имеют сравнительно более высокую линейность между количеством белка и интенсивностью цвета, примерно на три порядка величины выше предела обнаружения , то есть количество белка можно оценить по интенсивности цвета. При использовании флуоресцентного белкового красителя трихлорэтанола последующее окрашивание белка исключается, если его добавляли к раствору геля и гель облучали УФ-светом после электрофореза.
При окрашивании кумасси гель фиксируется в 50% этаноле и 10% растворе ледяной уксусной кислоты в течение 1 часа. Затем раствор заменяют на свежий и через 1–12 часов гель заменяют на окрашивающий раствор (50% метанол, 10% ледяная уксусная кислота, 0,1% кумасси бриллиантовый синий) с последующим обесцвечиванием, меняя несколько раз обесцвечивающий раствор 40%. метанол, 10% ледяная уксусная кислота.
Анализ
Окрашивание белков в геле создает документально подтвержденный рисунок полос различных белков. Гликопротеины имеют разные уровни гликозилирования и более неравномерно адсорбируют SDS при гликозилировании, что приводит к более широким и размытым полосам. Мембранные белки , из-за их трансмембранного домена , часто состоят из более гидрофобных аминокислот, имеют более низкую растворимость в водных растворах, имеют тенденцию связывать липиды и имеют тенденцию осаждаться в водных растворах из-за гидрофобных эффектов при отсутствии достаточного количества детергента. . Это преципитация проявляется для мембранных белков в SDS-PAGE в «хвосте» над полосой трансмембранного белка. В этом случае можно использовать больше SDS (за счет использования более или более концентрированного буфера для образца), и количество белка в приложении для образца может быть уменьшено. Перегрузка геля растворимым белком создает полукруглую полосу этого белка (например, в маркерной полосе изображения при 66 кДа), позволяя покрыть другие белки с аналогичными молекулярными массами. Низкий контраст (как на маркерной полосе изображения) между полосами внутри полосы указывает либо на присутствие многих белков (низкая чистота), либо, если используются очищенные белки и низкий контраст наблюдается только ниже одной полосы, это указывает на протеолитическую деградацию. белка, который сначала вызывает полосы деградации, а после дальнейшей деградации дает однородный цвет («мазок») под полосой. Документирование рисунка полос обычно делается путем фотографирования или сканирования. Для последующего выделения молекул в отдельных полосах может быть проведена экстракция гелем .
Архивирование
После окрашивания белка и документирования рисунка полос полиакриламидный гель можно высушить для архивного хранения. Позднее из него можно будет извлечь белки. Гель помещают в сушильную раму (с использованием тепла или без него) или в вакуумную сушилку. Рама для сушки состоит из двух частей, одна из которых служит основой для влажной целлофановой пленки, к которой добавляются гель и однопроцентный раствор глицерина . Затем накладывается вторая влажная целлофановая пленка без пузырьков, вторая часть рамки надевается сверху и рамка фиксируется зажимами. Удаление пузырьков воздуха позволяет избежать фрагментации геля во время сушки. Вода испаряется через целлофановую пленку. В отличие от сушильной рамы, вакуумная сушилка создает вакуум и нагревает гель примерно до 50 ° C.
Определение молекулярной массы
Для более точного определения молекулярной массы в разделяющем геле измеряют расстояния относительной миграции отдельных полос белка. Для повышения точности измерения обычно проводят в трех экземплярах. Относительная подвижность (называемая значением Rf или значением Rm) представляет собой частное от расстояния полосы белка и расстояния до фронта буфера. Расстояния полос и фронт буфера измеряются от начала разделительного геля. Расстояние перед буфером примерно соответствует расстоянию до бромфенолового синего, содержащегося в буфере для образца. Относительные расстояния между белками маркера размера нанесены на график полулогарифмически относительно их известных молекулярных масс. Путем сравнения с линейной частью построенного графика или с помощью регрессионного анализа молекулярная масса неизвестного белка может быть определена по его относительной подвижности. Полосы белков с гликозилированием могут быть размытыми. Белки с множеством основных аминокислот (например, гистоны ) могут привести к завышению молекулярной массы или даже не мигрировать в гель вообще, потому что при электрофорезе они перемещаются медленнее из-за положительных зарядов или даже в противоположном направлении. Соответственно, многие кислые аминокислоты могут привести к ускоренной миграции белка и занижению его молекулярной массы.
Приложения
SDS-PAGE в сочетании с окрашиванием белков широко используется в биохимии для быстрого и точного разделения и последующего анализа белков. Он требует сравнительно низких затрат на приборы и реагенты и является простым в использовании методом. Из-за своей низкой масштабируемости он в основном используется в аналитических целях и меньше - в препаративных, особенно когда необходимо выделить большие количества белка.
Кроме того, SDS-PAGE используется в сочетании с вестерн-блоттингом для определения присутствия определенного белка в смеси белков или для анализа посттрансляционных модификаций . Посттрансляционные модификации белков могут приводить к другой относительной подвижности (т. Е. Сдвигу полосы ) или к изменению связывания детектирующего антитела, используемого в вестерн-блоттинге (т. Е. Полоса исчезает или появляется).
В масс-спектрометрии белков SDS-PAGE является широко используемым методом подготовки проб перед спектрометрией, в основном с использованием расщепления в геле . Что касается определения молекулярной массы белка, SDS-PAGE немного более точен, чем аналитическое ультрацентрифугирование , но менее точен, чем масс-спектрометрия или, игнорируя посттрансляционные модификации, расчет молекулярной массы белка по ДНК. последовательность .
В медицинской диагностике SDS-PAGE используется как часть теста на ВИЧ и для оценки протеинурии . В тесте на ВИЧ белки ВИЧ разделяются с помощью SDS-PAGE и впоследствии обнаруживаются с помощью вестерн-блоттинга с использованием ВИЧ-специфических антител пациента, если они присутствуют в его сыворотке крови . SDS-PAGE для протеинурии оценивает уровни различных белков сыворотки в моче, например альбумина , альфа-2-макроглобулина и IgG .
Варианты
SDS-PAGE - это наиболее широко используемый метод гель-электрофоретического разделения белков. Двумерный гель-электрофорез последовательно сочетает изоэлектрическое фокусирование или ВАС-ПААГ с SDS-ПААГ. Native PAGE используется, если необходимо сохранить укладку нативного белка. Для разделения мембранных белков BAC-PAGE или CTAB-PAGE можно использовать в качестве альтернативы SDS-PAGE. Для электрофоретического разделения более крупных белковых комплексов можно использовать электрофорез в агарозном геле , например SDD-AGE . Некоторые ферменты можно определить по их активности с помощью зимографии .
Альтернативы
Будучи одним из наиболее точных и недорогих методов разделения и анализа белков, SDS-PAGE денатурирует белки. Если необходимы неденатурирующие условия, белки разделяют с помощью нативного PAGE или других хроматографических методов с последующим фотометрическим количественным определением , например аффинной хроматографией (или даже тандемной аффинной очисткой ), эксклюзионной хроматографией , ионообменной хроматографией . Белки также можно разделить по размеру при фильтрации с тангенциальным потоком или ультрафильтрации . Отдельные белки могут быть выделены из смеси с помощью аффинной хроматографии или анализа методом « выталкивания» . Некоторые исторически ранние и экономически эффективные, но грубые методы разделения обычно основаны на серии экстракций и осаждений с использованием космотропных молекул, например осаждение сульфатом аммония и осаждение полиэтиленгликоля .
История
В 1948 году Арне Тизелиус был удостоен Нобелевской премии по химии за открытие принципа электрофореза как миграции заряженных и растворенных атомов или молекул в электрическом поле. Использование твердой матрицы (первоначально бумажных дисков) в зонном электрофорезе улучшило разделение. Прерывистый электрофорез 1964 г., проведенный Л. Орнштейном и Б. Дж. Дэвисом, позволил улучшить разделение за счет эффекта суммирования. Использование сшитых полиакриламидных гидрогелей, в отличие от ранее использовавшихся бумажных дисков или крахмальных гелей, обеспечило более высокую стабильность геля и отсутствие микробного разложения. Денатурирующий эффект SDS в полиакриламидных гелях непрерывного действия и последующее улучшение разрешения были впервые описаны в 1965 году Дэвидом Ф. Саммерсом в рабочей группе Джеймса Э. Дарнелла по разделению полиовирусных белков. Текущий вариант SDS-PAGE был описан в 1970 году Ульрихом К. Лэммли и первоначально использовался для характеристики белков в головке бактериофага Т4 . Эта статья Лэммли широко цитируется как изобретение современного SDS-PAGE, но на самом деле этот метод был изобретен Джейком Майзелем, который проводил творческий отпуск в лаборатории MRC, когда Лэммли присоединился к лаборатории в качестве постдокторанта. Майзель поделился своей предыдущей технологией с Лэммли, и вместе они внесли дальнейшие улучшения. Лэммли и Майзель планировали продолжить работу с докладом о методах, но этого не произошло. Майзель кратко излагает историю развития SDS-PAGE.
использованная литература
внешние ссылки
- Протокол для BisTris SDS-PAGE на OpenWetWare.org