Рибозим - Ribozyme

Эта статья о химическом веществе. Для рок-группы см. Ribozyme (группа) .
Трехмерная структура рибозима головки молотка

Рибозимо ( рибо нуклеиновая кислота ан Zyme ы) РНК молекула , которые обладают способностью катализировать специфические биохимические реакции, в том числе сплайсинга РНКА в экспрессии генов , аналогично действие белковых ферментов . Открытие рибозимов в 1982 году продемонстрировало, что РНК может быть как генетическим материалом (например, ДНК ), так и биологическим катализатором (например, белковыми ферментами), и внесло свой вклад в гипотезу мира РНК , которая предполагает, что РНК, возможно, играла важную роль в эволюции пребиотической самости. реплицирующие системы. Наиболее распространенными действиями природных или созданных in vitro рибозимов являются расщепление или лигирование РНК и ДНК и образование пептидных связей. Внутри рибосомы рибозимы функционируют как часть большой субъединицы рибосомной РНК, связывая аминокислоты во время синтеза белка . Они также участвуют во множестве реакций процессинга РНК , включая сплайсинг РНК , вирусную репликацию и биосинтез транспортной РНК . Примеры рибозимов включают молот рибозит , в рибозит VS , Свинцовый Рибозят и шпильку рибозит .

Исследователи, изучающие происхождение жизни, получили в лаборатории рибозимы , которые способны катализировать собственный синтез из активированных мономеров в очень специфических условиях, таких как рибозим РНК-полимеразы . Мутагенез и отбор были выполнены, в результате чего были выделены улучшенные варианты полимеразного рибозима "Round-18" 2001 года. "B6.61" способен добавлять до 20 нуклеотидов к матрице праймера за 24 часа, пока не разложится путем расщепления. его фосфодиэфирных связей. Рибозим «tC19Z» может добавлять до 95 нуклеотидов с точностью 0,0083 мутации / нуклеотид.

Были предприняты попытки разработать рибозимы в качестве терапевтических агентов, в качестве ферментов, нацеленных на определенные последовательности РНК для расщепления, в качестве биосенсоров , а также для применения в функциональной геномике и открытии генов.

Открытие

Схема, показывающая расщепление РНК рибозимом.

До открытия рибозимов ферменты , которые определяют как каталитические белки , были единственными известными биологическими катализаторами . В 1967 году Карл Вёзе , Фрэнсис Крик и Лесли Оргел первыми предположили, что РНК может действовать как катализатор. Эта идея была основана на открытии того, что РНК может образовывать сложные вторичные структуры . Эти рибозимы были обнаружены в интроне РНК-транскрипта, который удалился из транскрипта, а также в РНК-компоненте комплекса РНКазы Р, который участвует в созревании пре- тРНК . В 1989 году Томас Р. Чех и Сидни Альтман разделили Нобелевскую премию по химии за «открытие каталитических свойств РНК». Термин рибозим был впервые введен Kelly Kruger et al. в 1982 г. в статье, опубликованной в Cell .

В биологии существовало твердое убеждение, что катализ предназначен только для белков. Однако идея катализа РНК частично мотивирована старым вопросом о происхождении жизни: что первично, ферменты, выполняющие работу клетки, или нуклеиновые кислоты, которые несут информацию, необходимую для производства ферментов? Концепция «рибонуклеиновые кислоты как катализаторы» позволяет обойти эту проблему. РНК, по сути, может быть как куриным, так и яйцом.

В 1980-х Томас Чех из Колорадского университета в Боулдере изучал удаление интронов в гене рибосомной РНК у Tetrahymena thermophila . Пытаясь очистить фермент, ответственный за реакцию сплайсинга, он обнаружил, что интрон может быть сплайсирован в отсутствие какого-либо добавленного клеточного экстракта. Как ни старались, Чех и его коллеги не смогли идентифицировать какой-либо белок, связанный с реакцией сплайсинга. После долгой работы Чех предположил, что часть интронной последовательности РНК может разрывать и восстанавливать фосфодиэфирные связи. Примерно в то же время Сидни Альтман, профессор Йельского университета , изучал способ процессинга молекул тРНК в клетке, когда он и его коллеги выделили фермент под названием РНКаза-P , который отвечает за превращение предшественника тРНК в клетку. активная тРНК. К своему большому удивлению они обнаружили, что РНКаза-P содержит РНК в дополнение к белку и что РНК является важным компонентом активного фермента. Это была настолько чужая идея, что им было трудно опубликовать свои выводы. В следующем году Альтман продемонстрировал, что РНК может действовать как катализатор, продемонстрировав, что субъединица РНКазы-P может катализировать расщепление тРНК-предшественника в активную тРНК в отсутствие какого-либо белкового компонента.

После открытия Чеха и Альтмана другие исследователи обнаружили другие примеры саморасщепляющейся РНК или каталитических молекул РНК. Многие рибозимы имеют активный центр в форме шпильки или головки молотка и уникальную вторичную структуру, которая позволяет им расщеплять другие молекулы РНК по определенным последовательностям. Теперь можно создавать рибозимы, которые будут специфически расщеплять любую молекулу РНК. Эти катализаторы РНК могут иметь фармацевтическое применение. Например, рибозим был разработан для расщепления РНК ВИЧ. Если бы такой рибозим был произведен клеткой, все поступающие вирусные частицы имели бы свой РНК-геном, расщепленный рибозимом, что предотвратило бы инфекцию.

Устройство и механизм

Несмотря на то, что для каждой мономерной единицы (нуклеотидов) имеется только четыре варианта выбора, по сравнению с 20 боковыми цепями аминокислот, обнаруженными в белках, рибозимы имеют различные структуры и механизмы. Во многих случаях они способны имитировать механизм, используемый их белками. Например, в саморасщепляющихся рибозимных РНК проточная реакция SN2 осуществляется с использованием 2'-гидроксильной группы в качестве нуклеофила, атакующего мостиковый фосфат и заставляющего 5'-кислород основания N + 1 действовать как уходящая группа. Для сравнения, РНКаза А, белок, который катализирует ту же реакцию, использует координирующий гистидин и лизин, чтобы действовать как основание для атаки на фосфатный остов.

Как и многие белковые ферменты, связывание металлов также имеет решающее значение для функционирования многих рибозимов. Часто эти взаимодействия используют как фосфатный остов, так и основание нуклеотида, вызывая резкие конформационные изменения. Существует два класса механизмов расщепления основной цепи фосфодиэфира в присутствии металла. В первом механизме внутренняя 2'-OH группа атакует фосфорный центр по SN 2 механизму. Ионы металлов способствуют этой реакции, сначала координируя фосфатный кислород, а затем стабилизируя оксианион. Второй механизм также следует за замещением SN 2 , но нуклеофил происходит из воды или экзогенных гидроксильных групп, а не из самой РНК. Самым маленьким рибозимом является UUU, который может способствовать расщеплению G и A тетрануклеотида GAAA по первому механизму в присутствии Mn 2+ . Причина, по которой этот тринуклеотид, а не комплементарный тетрамер катализирует эту реакцию, может заключаться в том, что спаривание UUU-AAA является самым слабым и наиболее гибким тринуклеотидом среди 64 конформаций, которые обеспечивают сайт связывания для Mn 2+ .

Перенос фосфорила также можно катализировать без ионов металлов. Например, рибонуклеаза поджелудочной железы А и рибозимы вируса гепатита дельта (HDV) могут катализировать расщепление основной цепи РНК посредством кислотно-основного катализа без ионов металлов. Рибозим шпильки также может катализировать саморасщепление РНК без ионов металлов, но механизм до сих пор неясен.

Рибозим также может катализировать образование пептидной связи между соседней аминокислотой за счет снижения энтропии активации.

Фотографии структуры рибозима
Изображение, показывающее разнообразие структур рибозима. Слева направо: свинец, рибозим в форме головки молотка, рибозим-твистер

мероприятия

Рибосомой является биологической машиной , которая использует рибосомы , чтобы перевести РНК в белках

Хотя рибозимы в большинстве клеток встречаются довольно редко, их роль иногда важна для жизни. Например, функциональная часть рибосомы , биологическая машина, которая переводит РНК в белки, по сути, представляет собой рибозим, состоящий из третичных структурных мотивов РНК , которые часто координируются с ионами металлов, такими как Mg 2+, в качестве кофакторов . В модельной системе, не существует никакого требования в отношении двухвалентных катионов в пять-нуклеотиде РНК катализирующего транса - phenylalanation из четырех нуклеотидов подложки с 3 парами оснований , комплементарных с катализатором, где катализатор / субстрат был изобретены усечением С3 рибозима .

Наиболее изученными рибозимами, вероятно, являются те, которые разрезают сами себя или другие РНК, как в оригинальном открытии Чеха и Альтмана. Однако рибозимы могут быть разработаны для катализирования ряда реакций (см. Ниже), многие из которых могут происходить в жизни, но не были обнаружены в клетках.

РНК может катализировать складывания патологического конформации белка в виде приона в манере , аналогичной той , что из шаперонина .

Рибозимы и происхождение жизни

РНК также может действовать как наследственная молекула, что побудило Уолтера Гилберта предположить, что в далеком прошлом клетка использовала РНК как генетический материал, так и структурную и каталитическую молекулу, а не разделяла эти функции между ДНК и белком, как сегодня; эта гипотеза известна как « гипотеза мира РНК » происхождения жизни . Так как нуклеотиды и РНК и , таким образом , рибозимо может возникнуть с помощью неорганических химических веществ, они являются кандидатами для первых ферментов , а на самом деле, первые «репликаторы», то есть информация , содержащая макро-молекула , которые копируют себя. Пример самовоспроизводящегося рибозима, который связывает два субстрата для создания точной копии самого себя, был описан в 2002 году. Открытие каталитической активности РНК разрешило парадокс "курица и яйцо" происхождения жизни, решив проблему происхождения. центральной догмы пептидов и нуклеиновых кислот. Согласно этому сценарию, в самом начале жизни вся ферментативная активность и кодирование генетической информации осуществлялось одной молекулой, РНК.

Искусственные рибозимы

С момента открытия рибозимов, существующих в живых организмах, возник интерес к изучению новых синтетических рибозимов, созданных в лаборатории. Например, были получены искусственно созданные саморасщепляющиеся РНК, обладающие хорошей ферментативной активностью. Тан и Брейкер выделили саморасщепляющиеся РНК путем отбора in vitro РНК, происходящих из РНК со случайной последовательностью. Некоторые из синтетических рибозимов, которые были произведены, имели новую структуру, в то время как некоторые были похожи на встречающийся в природе рибозим в форме головки молотка. В 2015 году исследователи из Северо-Западного университета и Университета Иллинойса в Чикаго сконструировали привязанную рибосому, которая работает почти так же хорошо, как подлинный клеточный компонент, который производит все белки и ферменты внутри клетки. Искусственная рибосома, получившая название « Рибосома-Т» или «Рибо-Т», была создана Майклом Джветтом и Александром Манкиным. Методы, используемые для создания искусственных рибозимов, включают направленную эволюцию. Этот подход использует двойную природу РНК как катализатора и информационного полимера, что упрощает для исследователя создание огромных популяций РНК-катализаторов с использованием ферментов полимеразы . Рибозимы мутируют путем обратной транскрипции их с помощью обратной транскриптазы в различные кДНК и амплифицируют с помощью подверженной ошибкам ПЦР . Параметры отбора в этих экспериментах часто различаются. Один из подходов к выбору лигазного рибозима включает использование биотиновых меток, которые ковалентно связаны с субстратом. Если молекула обладает желаемой лигазной активностью, матрицу из стрептавидина можно использовать для извлечения активных молекул.

Линкольн и Джойс разработали ферментную систему РНК, способную к самовоспроизведению примерно за час. Путем использования молекулярной конкуренции ( эволюция in vitro ) смеси РНК-кандидата возникла пара рибозимов, каждый из которых синтезирует другой, соединяя синтетические олигонуклеотиды без присутствия белка.

Хотя это и не являются настоящими катализаторами, создание искусственных саморасщепляющихся рибопереключателей, называемых аптазимами, также является активной областью исследований. Рибопереключатели представляют собой регуляторные мотивы РНК, которые изменяют свою структуру в ответ на низкомолекулярный лиганд, регулирующий трансляцию. Хотя существует множество известных природных рибопереключателей, которые связывают широкий спектр метаболитов и других небольших органических молекул, был описан только один рибозим на основе рибопереключателя, glmS . Ранние работы по характеристике саморасщепляющихся рибопереключателей были сосредоточены на использовании теофиллина в качестве лиганда. В этих исследованиях образуется шпилька РНК, которая блокирует сайт связывания рибосомы , тем самым подавляя трансляцию. В присутствии лиганда , в этих случаях теофиллина, регуляторная область РНК отщепляется, позволяя рибосоме связываться и транслировать целевой ген. Большая часть этой работы по разработке РНК была основана на рациональном дизайне и ранее определенных структурах РНК, а не на направленной эволюции, как в приведенных выше примерах. Более поздняя работа расширила лиганды, используемые в рибозимных переключателях, включив пирофосфат тимина (2). Сортировка клеток, активируемая флуоресценцией , также использовалась для конструирования аптазимов.

РНК-полимераза рибозим

Считается, что современная жизнь, основанная в основном на ДНК как генетическом материале, произошла от организмов, основанных на РНК, в более раннем мире РНК . Жизнь РНК зависела бы от рибозима РНК-зависимой РНК-полимеразы для копирования функциональных молекул РНК, включая копирование самой полимеразы. Tjhung et al. получили в результате эволюции in vitro рибозим РНК-полимеразы, который обладает беспрецедентным уровнем активности в копировании сложных молекул РНК. Однако этот рибозим не может копировать себя, а его РНК-продукты имеют высокую скорость мутаций . Тем не менее, продолжается прогресс в достижении цели получения путем эволюции in vitro точного, эффективного самовоспроизводящегося рибозима РНК-полимеразы, чтобы улучшить понимание ранней эволюции жизни.

Саманта и Джойс обнаружили, что высокоразвитый рибозим РНК-полимеразы способен функционировать как обратная транскриптаза , то есть может синтезировать копию ДНК с использованием матрицы РНК. Считается, что такая деятельность имела решающее значение для перехода от геномов РНК к ДНК на раннем этапе существования жизни на Земле. Способность к обратной транскрипции могла возникнуть как вторичная функция рибозима ранней РНК-зависимой РНК-полимеразы.

Приложения

Рибозимы были предложены и разработаны для лечения заболеваний с помощью генной терапии (3). Одной из основных проблем использования ферментов на основе РНК в качестве терапевтических средств является короткий период полужизни каталитических молекул РНК в организме. Чтобы бороться с этим, положение 2 'на рибозе модифицируется для повышения стабильности РНК. Одной из областей генной терапии рибозимов является ингибирование вирусов на основе РНК.

Был разработан синтетический рибозим, направленный против РНК ВИЧ, называемый генными ножницами, который прошел клинические испытания на ВИЧ-инфекцию.

Точно так же рибозимы были разработаны для нацеливания на РНК вируса гепатита С, коронавируса SARS (SARS-CoV), аденовируса и РНК вирусов гриппа A и B. Рибозим способен расщеплять консервативные области генома вируса, что, как было показано, снижает вирус в культуре клеток млекопитающих. Несмотря на эти усилия исследователей, эти проекты остались на доклинической стадии.

Известные рибозимы

Хорошо подтвержденные классы встречающихся в природе рибозимов:

Смотрите также

Примечания и ссылки

дальнейшее чтение

  • Сигель А, Сигель Х, Сигель РК (2011). Структурная и каталитическая роль ионов металлов в РНК . Ионы металлов в науках о жизни . 9 . Издательство РСК. стр. vii – ix. DOI : 10.1039 / 9781849732512 . ISBN 978-1-84973-251-2. PMID  22010266 .
  • Джонсон-Бак А.Е., Макдауэлл С.Е., Уолтер Н.Г. (2011). «6. Ионы металлов: второстепенные участники в сборнике малых рибозимов». Ионы металлов: вспомогательные действующие лица в игре малых рибозимов . Ионы металлов в науках о жизни . 9 . С. 175–96. DOI : 10.1039 / 9781849732512-00175 . ISBN 978-1-84973-094-5. PMC  3365584 . PMID  22010272 .
  • Донги Д., Шнабл Дж. (2011). «7. Множественная роль ионов металлов в больших рибозимах». Множественные роли ионов металлов в больших рибозимах . Ионы металлов в науках о жизни . 9 . С. 197–234. DOI : 10.1039 / 9781849732512-00197 . ISBN 978-1-84973-094-5. PMID  22010273 .
  • Траппл К., Полачек Н. (2011). Рибосома: молекулярная машина, работающая на РНК . Ионы металлов в науках о жизни . 9 . С. 253–75. DOI : 10.1039 / 9781849732512-00253 . ISBN 978-1-84973-094-5. PMID  22010275 .
  • Шуга Х, Футаи К., Джин К. (2011). «10. Требования к ионам металлов в искусственных рибозимах, которые катализируют аминоацилирование и окислительно-восстановительные реакции». Требования к ионам металлов в искусственных рибозимах, катализирующих аминоацилирование и окислительно-восстановительные реакции . Ионы металлов в науках о жизни . 9 . С. 277–97. DOI : 10.1039 / 9781849732512-00277 . ISBN 978-1-84973-094-5. PMID  22010276 .
  • Ведекинд JE (2011). «11. Связывание ионов металлов и их функции в природных и искусственных ферментах малых РНК со структурной точки зрения». Связывание ионов металлов и их функции в естественных и искусственных ферментах малых РНК со структурной точки зрения . Ионы металлов в науках о жизни . 9 . С. 299–345. DOI : 10.1039 / 9781849732512-00299 . ISBN 978-1-84973-094-5. PMID  22010277 .
  • Доэрти Э.А., Дудна Дж. А. (2001). «Структуры и механизмы рибозима». Ежегодный обзор биофизики и структуры биомолекул . 30 : 457–75. DOI : 10.1146 / annurev.biophys.30.1.457 . PMID  11441810 .
  • Джойс Г.Ф. (2004). «Направленная эволюция ферментов нуклеиновых кислот». Ежегодный обзор биохимии . 73 : 791–836. DOI : 10.1146 / annurev.biochem.73.011303.073717 . PMID  15189159 .
  • Икава Ю., Цуда К., Мацумура С., Иноуэ Т. (сентябрь 2004 г.). «Синтез de novo и разработка фермента РНК» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 101 (38): 13750–5. Bibcode : 2004PNAS..10113750I . DOI : 10.1073 / pnas.0405886101 . PMC  518828 . PMID  15365187 .

внешние ссылки