Фотореактивный аналог аминокислоты - Photo-reactive amino acid analog
Фотореактивные аналоги аминокислот - это искусственные аналоги природных аминокислот, которые можно использовать для сшивания белковых комплексов. Фотореактивные аналоги аминокислот могут быть включены в белки и пептиды in vivo или in vitro . Фотореактивная аналоги аминокислот общего пользования являются фотореактивные diazirine аналогами лейцина и метионина , и пара -benzoylphenylalanine. Под воздействием ультрафиолетового света они активируются и ковалентно связываются с взаимодействующими белками, которые находятся в пределах нескольких ангстрем от фотореактивного аналога аминокислоты.
L-лейцин-фото и L -Photo-метионин являются аналогами природного происхождения L - лейцин и L метионина аминокислот, которые эндогенно включены в первичной последовательности белков в процессе синтеза с помощью обычной техники перевода. Затем их активируют ультрафиолетовым светом (УФ) для ковалентного сшивания белков внутри доменов межбелкового взаимодействия в их естественной среде in vivo . Метод позволяет определять и характеризовать как стабильные, так и временные белковые взаимодействия в клетках без добавления химических сшивающих агентов и связанных с ними растворителей, которые могут отрицательно повлиять на биологию клетки, изучаемую в эксперименте.
При использовании в сочетании с ограничивающей средой, лишенной лейцина и метионина, фотоактивируемые производные обрабатываются аппаратом синтеза клеточного белка как встречающиеся в природе аминокислоты . В результате они могут заменять лейцин или метионин в первичной структуре белков. Производные фото-лейцина и фото-метионина содержат диазириновые кольца, которые активируются под воздействием ультрафиолетового света и становятся реактивными промежуточными продуктами, которые образуют ковалентные связи с соседними боковыми цепями и скелетами белка. Естественно взаимодействующие белки внутри клетки могут быть мгновенно захвачены фотоактивацией диазирин-содержащих белков в культивируемых клетках. Сшитые белковые комплексы могут быть обнаружены по снижению подвижности на SDS-PAGE с последующим вестерн-блоттингом , эксклюзионной хроматографией , седиментацией в градиенте плотности сахарозы или масс-спектрометрией .
Ссылки
- Вила-Перелло М. и др. (2007). Ковалентный захват фосфо-зависимой олигомеризации белка за счет сайт-специфического включения диазиринового фото-перекрестно-сшивающего линкера. Варенье. Chem. Soc., 129 (26): 8068–69.
- Бомгарден, Р. (2008). Изучение взаимодействия белков в живых клетках. Gen. Eng. Новости. Vol. 28, № 7. [1]
- П.-О. Хету и др. (2008) Фото-сшивание белков в интактных клетках выявляет димерную структуру циклооксигеназы-2 и чувствительную к ингибитору олигомерную структуру микросомальной простагландин E2-синтазы-1. Arch. Biochem. Биофиз. DOI : 10.1016 / j.abb.2008.04.038
- Weaver, MS, et al. (2008) Медь-связывающий домен sparc опосредует выживание клеток in vitro посредством взаимодействия с интегрином бета 1 и активации интегрин-связанной киназы. J. Biol. Chem. DOI : 10,1074 / jbc.M706563200