Перлекан - Perlecan
Перлекана (PLC) , также известная как базальная мембрана конкретного гепарансульфата протеогликанов основного белок (HSPG) или гепарансульфат протеогликан 2 ( HSPG2 ), представляет собой белка , который у человека кодируется HSPG2 геном .
Перлекан был первоначально выделен из линии опухолевых клеток, и было показано, что он присутствует во всех нативных базальных мембранах. Перлекан представляет собой большой мультидоменный (пять доменов, обозначенных IV) протеогликан, который связывается и перекрестно связывает многие компоненты внеклеточного матрикса (ЕСМ) и молекулы клеточной поверхности . Перлекан синтезируется как эндотелиальными, так и гладкомышечными клетками сосудов и откладывается во внеклеточном матриксе. Перлекан высоко консервативен у разных видов, и имеющиеся данные показывают, что он произошел от древних предков путем дупликации генов и перетасовки экзонов .
Состав
Перлекан состоит из основного белка с молекулярной массой 470 кДа, к которому присоединены три длинные цепи (каждая примерно 70-100 кДа) гликозаминогликанов (часто гепарансульфат , HS, но может быть хондроитинсульфат , CS). Основной белок состоит из пяти отдельных структурных доменов . N-концевой домен I (аа ~ 1-195) содержит крепежные узлы для HS цепей. Хотя цепи HS не требуются для правильной укладки и секреции белка, отсутствие HS или снижение сульфатирования может снизить способность перлекана взаимодействовать с матричными белками. Удаление цепей HS может повлиять на организацию матрикса и функцию эндотелиального барьера. Домен II включает четыре повтора, гомологичных лиганд-связывающей части рецептора ЛПНП с шестью консервативными остатками цистеина и пентапептидом, DGSDE, который опосредует связывание лиганда рецептором ЛПНП. Домен III гомологичен доменам IVa и IVb ламинина . Домен IV состоит из серии модулей IG . С-концевой домен V, который гомологичен домену G длинного плеча ламинина, отвечает за самосборку и может быть важным для образования базальной мембраны in vivo. Домен V также имеет сайты подключения для цепочек HS / CS. Таким образом, сердцевинный белок перлекана и цепи HS могут модулировать сборку матрикса, пролиферацию клеток , связывание липопротеинов и клеточную адгезию .
Функция
Перлекан является ключевым компонентом внеклеточного матрикса хряща, где он необходим для нормального развития пластинки роста и роста длинных костей. Карликовость, проявляемая перлекан-нулевой мышью, напоминает фенотип, вызванный активацией мутаций в гене FGFR3, рецептора факторов роста фибробластов. Перлекан связывается с факторами роста, участвующими в развитии пластинки роста. Было показано, что перлекан, выделенный из развивающихся пластинок роста, связывается с FGF-2 через его боковые цепи гепарансульфата и с FGF-18 через домен III его основного белка и опосредует их действие на рецепторы FGF. Перлекан, вероятно, играет критическую роль в секвестрации и / или доставке FGF-2 и FGF-18 во время эндохондральной оссификации.
Перлекан также является ключевым компонентом внеклеточного матрикса сосудов, где он взаимодействует с множеством других компонентов матрикса и помогает поддерживать функцию эндотелиального барьера. Перлекан является мощным ингибитором пролиферации гладкомышечных клеток и, таким образом, считается, что он помогает поддерживать гомеостаз сосудов. Перлекан также может стимулировать активность фактора роста (например, FGF2 ) и, таким образом, стимулировать рост и регенерацию эндотелия.
Модификация цепей гликозаминогликанов
Модификации гепарансульфатных цепей на C- и N-концевых доменах являются наиболее изученными различиями в секреторном пути перлекана. Хондроитинсульфат можно заменить на гепарансульфат, и включение сульфата или сахарный состав цепей могут измениться. Потеря ферментов, участвующих в синтезе гепарансульфата, приводит к ряду состояний.
Дифференциальная модификация гепарансульфатной цепи может происходить с помощью ряда регуляторных сигналов. Перлекан в пластинке роста длинных костей мыши показывает изменения гликозилирования при продвижении хондроцитов из зоны покоя в зону пролиферации. Хотя первоначально считалось, что цепи гликозаминогликанов (ГАГ) перлекана представляют собой исключительно гепарансульфат, цепи хондроитинсульфата могут быть замещены, и это может зависеть от типа клетки. Путем экспрессии рекомбинантной формы N-концевого домена I белка и демонстрации того, что переваривание пептида гепараназой или хондроитиназой не привело к полной потере активности пептида, было показано, что цепи хондроитинсульфата могут быть добавлены к человеческому организму. перлекан. Это согласуется с предыдущими данными, показывающими, что цепи GAG хондроитинсульфата присоединены к бычьему перлекану, продуцируемому хондроцитами, и что рекомбинантный белок домена I человека гликозилировался как цепями гепарана, так и цепями хондроитинсульфата при экспрессии в клетках яичника китайского хомячка. Предпочтительное добавление цепей гепарансульфата или хондроитинсульфата к доменам I и V могло бы повлиять на дифференцировку мезенхимальных тканей в хрящ, кость или любое количество тканей, но регуляторный механизм изменения от гепарансульфата к добавлению хондроитинсульфата не понятно хорошо.
При изучении влияния протеогликановой композиции на нефритную проницаемость было отмечено, что обработка пуромицином гломерулярных эндотелиальных клеток человека (HGEC) изменяла уровень сульфатирования цепей GAG на протеогликанах, таких как перлекан, что, в свою очередь, приводило к снижению стабильности GAG. цепи. Коровый белок уровни мРНК протеогликанов не были затронуты, таким образом , уменьшение GAG цепей было в результате какого - либо другого фактора, который в данном случае оказалось уменьшение экспрессии сульфата трансферазы ферменты, которые играют ключевую роль в GAG биосинтез. Похоже, что может быть некоторое перекрытие в заболеваниях, возникающих из-за потери экспрессии гепарансульфат-протеогликана и потери ферментов, участвующих в биосинтезе гепарансульфата.
Деградация
Клетки могут изменять свой внеклеточный матрикс и базальные мембраны в ответ на сигналы или стресс. Специфические протеазы действуют на белок во внеклеточной среде, когда у клеток есть причина двигаться или изменять свое окружение. Катепсин S представляет собой цистеиновую протеазу, которая умеренно ослабляет связывание FGF-положительных клеток с перлекан-положительным субстратом. Катепсин S представляет собой потенциальную протеазу, которая действует на основной белок перлекана в базальной мембране или строме.
Гепарансульфатные цепи перлекана связывают факторы роста в ЕСМ и служат в качестве со-лигандов или усилителей лигандов при связывании с рецепторами. Другое исследование показало, что высвобождение связанного с HS основного FGF в культуре может быть достигнуто путем обработки стромелизином, гепаритиназой I, крысиной коллагеназой и плазмином, и эти сайты протеолиза показаны на рисунке 1. Это было предложено в качестве неполного списка протеазы, которые могут опосредовать высвобождение факторов роста из гепарансульфатных цепей перлекана. Хотя Whitelock et al. предположили, что консенсусные последовательности расщепления тромбином существуют в коровом белке перлекана, они также постулируют, что любая активация перлекана тромбином на самом деле происходит в результате расщепления других компонентов ЕСМ. В этой статье говорится, что гепараназа отвечает за расщепление гепарансульфатных цепей перлекана в матриксе. Это высвобождает факторы роста, связанные с гепарансульфатом, в частности, FGF-10. Добавление гепараназы к культуре клеток эпителия в базальной мембране вызывало увеличение пролиферации эпителиальных клеток за счет высвобождения FGF-10.
В модели роста эксплантата in vitro с использованием эпителия роговицы экспрессия матриксной металлопротеиназы (ММР) 2 коррелирует с начальной деградацией исходной базальной мембраны. Реформация базальной мембраны в культуре зависела от начальной активации, за которой следовало подавление MMP-9, в отличие от постоянной экспрессии MMP-2. Это не является доказательством того, что ММР-2 и ММР-9 непосредственно расщепляют белок перлекан in vivo, но показывает, что белки явно модулируют некоторый фактор созревания базальной мембраны. Другое семейство металлопротеаз, семейство Bone Morphogenetic Protein 1 / Tolloid-like, высвобождает c-концевой эндорепеллиновый домен корового белка перлекана. Ламинин-подобный глобулярный домен содержит активный мотив эндорепеллина и не может быть расщеплен клетками, экспрессирующими мутантные и неактивные формы белков BMP-1. Кроме того, критический остаток, необходимый для этого расщепления, был локализован в Asp4197. Этот протеолитический процесс может иметь значение при заболевании, поскольку соответствующий фрагмент был обнаружен в моче пациентов с терминальной почечной недостаточностью и в околоплодных водах беременных женщин, перенесших преждевременный разрыв мембраны.
Выражение
Выражение во время разработки
Время экспрессии генов во время развития варьируется от ткани к ткани. Базальные мембраны часто являются движущей силой отделения эпителия от стромы и соединительной ткани. Перлекан имеет особое значение для развития сердечно-сосудистой системы, нервной системы и хрящей.
Развитие бластоцисты до имплантации - это управляемый каскад регуляции генов и межклеточной передачи сигналов. Внеклеточный перлекан наблюдался на стадии бластоцисты эмбрионального развития мыши, специфически активируемый в момент, когда эмбрион достигает «компетентности прикрепления». Это открытие подтвердилось как на уровне мРНК, так и на уровне белка, что было показано с помощью ОТ-ПЦР и иммуноокрашивания. Позднее эмбриональное развитие регулируется так же точно, как и доимплантационное развитие, и является более сложным из-за дифференцировки всех тканей. Первое исследование экспрессии перлекана во время эмбрионального развития показало, что белок сначала экспрессируется во время развития сердечно-сосудистой системы, а затем коррелирует с созреванием большинства тканей тела, то есть отделением эпителиальных слоев от эндотелия и стромы базальными мембранами. Опять же, эта активация во время сердечно-сосудистого развития сопровождается ролью С-конца перлекана как эндорепеллина.
Пространственно-временная специфичность трансактивации гена перлекана во время развития является ключом к созреванию базальных мембран и, таким образом, к полному отделению эпителия от эндотелия и стромы. Тщательное изучение экспрессии перлекана во время развития куриного эмбриона показало, что перлекан присутствует на стадии морулы и для остального развития, хотя экспрессия может быть временной и точно рассчитанной по времени в определенных тканевых предшественниках. Было показано, что в эмбрионе крысы экспрессия перлекана увеличивается в гладкомышечных клетках сосудов (VSMC) после е19 в процессе внутриутробного развития. Это прекрасно коррелирует с прекращением пролиферации VSMCs на e18 и изменением их фенотипа. Теория, выдвинутая в этом исследовании, заключается в том, что перлекан играет антипролиферативную роль для VSMC после достижения определенной точки развития, во многом подобно зависимой от слияния экспрессии перлекана в культуре. Эти результаты были подтверждены аналогичными результатами исследований легочной артерии и эпителия легких крыс. Также было обнаружено, что эти ткани начинают продуцировать перлекан после прекращения деления клеток, примерно на 19-й день плода.
Развитие нервной системы и расширение аксонов точно регулируется сигналами молекул внеклеточного матрикса. Рост обонятельных нейритов в развитии мышей управляется, по крайней мере частично, ECM, заложенным обонятельными эпителиальными клетками (OECs). Перлекан и ламинин-1, по-видимому, играют важную роль в этом пути наведения, хотя индукция перлекана происходит немного позже, чем ламинин-1. Эти данные подтверждаются более ранними данными, показывающими, что OECs экспрессируют FGF-1 во время обонятельного развития, и что перлекан может стимулировать рост обонятельных сенсорных нейритов в культуре в присутствии FGF-1. Перлекан также показал адгезивные свойства нервов в предыдущем исследовании, что также предполагает, что он может играть привлекательную роль в сочетании с ламинином, а не отталкивать.
Доказано, что развитие хрящей и костей зависит от экспрессии перлекана. Белок становится видимым при иммуноокрашивании на 15-й день во время развития мыши, независимо от других белков базальной мембраны, что позволяет предположить, что он просто является частью ECM развивающихся хондроцитов в дополнение к коллагену II и другим маркерам хряща, которые экспрессируются, начиная с 12-го дня. Принимая во внимание данные о том, что мыши, лишенные гена pln, не могут поддерживать стабильный хрящ, очевидно, что перлекан необходим для созревания и стабильности хрящевой структуры. Это подтверждается исследованием, показывающим, что подавление продукции перлекана ингибирует заключительные стадии хондрогенной дифференцировки в фибробластах C3H10T1 / 2 в культуре. Развитие костей, то есть минерализация хрящевой ткани, коррелирует с потерей перлекана и гепарансульфата в хондро-костном соединении (ХПК). Чтобы понять, как гепарансульфат и перлекан направляют мезенхимальные стволовые клетки в остеогенный путь, мезенхимальные стволовые клетки человека обрабатывали гепараназой и хондроитиназой в культуре. Это привело к увеличению минерализации и экспрессии маркеров остеоцитов, что подтверждает данные, показывающие, что потеря гепарансульфата в COJ является ключевым фактором в остеогенезе. Считается, что движущей силой активации остеогенеза гепараназой и хондроитиназой является высвобождение костного морфогенетического белка, связанного в цепях гепарансульфата.
Модели животных
Перлекана нокдаун в эмбриональном данио было достигнуто за счет использования Morpholinos ориентированы на перлекана транскрипта. Морфолино использовали для блокирования трансляции мРНК перлекана у эмбрионов рыбок данио в рамках исследования функции перлекана в развитии скелета и сосудов. Morpholino нацелен на пять первичных нетранслируемых областей мРНК перлекана, таким образом блокируя трансляцию сообщения. Потеря белка перлекана у этих рыб привела к серьезным миопатиям и проблемам с кровообращением. Как показано в более позднем исследовании, проведенном в той же лаборатории, этот фенотип можно исправить путем добавления экзогенного VEGF-A.
Важность перлекана для развития млекопитающих продемонстрирована экспериментами с нокаутом гена перлекана. Почти половина всех мышей, у которых был нокаутирован ген перлекана (мыши с нулевым перлеканом), умирают в эмбриональный день 10,5, когда ген перлекана обычно начинает экспрессироваться. Другие умирают сразу после рождения с серьезными дефектами, такими как аномальное формирование базальной мембраны , дефект развития головных и длинных костей и ахондроплазия . Стратегия нокаута, использованная для одного из нокаутов перлекана, заключалась в флоксировании экзона 6 путем вставки кассеты неомицина и последующей экспрессии CRE для удаления экзона 6 из генома. Это привело к ранее обсуждавшемуся фенотипу с нарушением хряща и потере целостности базальной мембраны во множестве тканей. Уровень внутриутробной смертности высок, и выжившие мыши умирают вскоре после рождения. Разработанная отдельно модель мыши с нокаутом перлекана была создана путем вставки кассеты неомицина в экзон 7 гена перлекана. У этих мышей с нокаутом также было 40% эмбриональной летальности, а остальные мыши умерли вскоре после рождения из-за серьезных аномалий скелета. Фенотип нокаута перлекана в обоих исследованиях был идентичен и сходен с фенотипом, вызванным активацией мутаций в гене FGFR3, рецептора факторов роста фибробластов.
Полноразмерную конструкцию перлекана под контролем промотора коллагена типа II использовали для получения трансгенной мыши с перлеканом. Промотор коллагена типа II обеспечивает экспрессию перлекана во внеклеточном матриксе, образованном только хондроцитами, но не в базальных мембранах, образованных эндотелиальными, эпителиальными или мышечными клетками. Этот трансген перлекана у мышей без перлекана исключил летальность и восстановил нормальный рост длинных костей. Однако у трансгенных мышей с перлеканом наблюдалась гипертрофия мышц, что указывает на роль перлекана в развитии мышц, а также в росте длинных костей, опосредованном пластинкой роста хряща.
В еще одной модели нокаута мышей ген перлекана мутировали путем гомологичной рекомбинации эндогенного гена перлекана с конструкцией, содержащей 2 и 5 т.п.н. плеч гомологии, окружающих удаленный экзон 3, который кодирует 2 из 3 сайтов присоединения гепарансульфата в домене Я перлекан. Однако перлекан, продуцируемый культивированными фибробластами мышей с нокаутом экзона 3, содержал 40% гепарансульфата и 60% хондроитинсульфата, потому что в дополнение к одному сайту присоединения гепарансульфата, оставшемуся в домене I, сайт присоединения в домене V также будет присутствовать. . Исследование показало, что мыши с нокаутом экзона 3 имели нарушение целостности капсулы хрусталика к 3-ей постнатальной неделе, что указывает на роль аминокислот, удаленных из домена I перлекана, в поддержании целостности базальной мембраны капсулы хрусталика. Однако, в отличие от мышей с нокаутом перлекана, жизнеспособность и рост длинных костей у мышей с нокаутом экзона 3 были нормальными. Это предполагает, что при нокауте экзона 3 оставшиеся сайты присоединения для гепарансульфата в доменах I и V, доступные для связывания FGF-2, или сайт в домене 3, доступный для связывания FGF-18, могут быть достаточными для нормального роста длинных костей.
Изменения хрусталика у мышей с нокаутом экзона 3 в некоторой степени похожи на модель мышей с нокаутом TGF-β. Мыши с нокаутом экзона 3 также показали снижение способности заживления ран и ангиогенеза при заражении либо повреждением эпидермиса, либо добавлением FGF-2 к роговице. В исследовании повреждения эпидермиса рана, охватывающая глубину эпидермиса, была создана у мышей с отрицательным экзоном 3 и контрольных мышей, а у мышей с нокаутом ангиогенез и признаки заживления ран развивались медленно, возможно, из-за снижения секвестрации фактора роста за счет гепарансульфат-отрицательный перлекан. Аналогичный результат был получен в анализе микрокарманов роговицы, где FGF-2 имплантировали в роговицу мышей и у нормальных мышей индуцировали ангиогенез. У мышей с нокаутом этот ангиогенный эффект был нарушен, хотя и не полностью.
Исследования на мышах с нокаутом гена и заболеваниях человека также выявили критическую роль перлекана in vivo в развитии хряща и активности нервно-мышечных соединений.
Сигнальные пути и их влияние на экспрессию
Сигнальные пути повышают или понижают уровни транскрипции генов, что, в свою очередь, заставляет клетки изменять профиль экспрессии генов. Конечный эффект сигнальных путей проявляется на промоторе генов, который может включать элементы выше или ниже сайта начала транскрипции, некоторые из которых могут существовать внутри самого транскрибируемого гена. Ряд сигнальных молекул может влиять на изменения в экспрессии перлекана, включая семейства молекул трансформирующего фактора роста-бета (TGF-β), интерлейкина (IL) и фактора роста эндотелия сосудов (VEGF).
Активация транскрипции
Вышестоящие 2,5 тыс. Оснований промоторной области перлекана изучали с помощью активации CAT в клеточных линиях различного гистологического происхождения. Это исследование пришло к выводу, что существует TGF-β-чувствительный элемент в промоторе всего на 285 пар оснований перед сайтом начала транскрипции. Этот результат был подтвержден на таких тканях, как клетки карциномы толстой кишки человека. и эпителий матки мышей путем добавления цитокина в среду для культивирования клеток in vitro. Исследования in vitro передачи сигналов TGF-β1 и его влияния на экспрессию перлекана могут иметь различные результаты в разных типах клеток. В клетках гладкой мускулатуры коронарных артерий человека в культуре передача сигналов TGF-β1 не показала влияния на экспрессию перлекана, хотя она действительно активировала другие составляющие матрикса. In vivo демонстрация динамической регуляции перлекана и его контроля с помощью внеклеточных сигнальных путей имеет решающее значение для нашего понимания роли белка в развитии. С этой целью была создана линия трансгенных мышей, экспрессирующих свиной TGF-β1 под линзоспецифическим промотором αA-кристаллина, а затем была создана другая подобная линия, но с геном, управляемым промотором βb-кристаллина, соответствующим другому линзоспецифическому гену. . Эта динамично развивающаяся ткань демонстрирует серьезную неправильную регуляцию компонентов внеклеточного матрикса, включая перлекан со сверхэкспрессией TGF-β1. Помутнение роговицы произошло у обеих трансгенных линий на ранней стадии развития из-за значительного увеличения экспрессии перлекана, фибронектина и тромбоспондина-1 в мезенхиме роговицы. Эффект был более выражен в линии, управляемой промотором βB-1 Crystallin.
Семейство воспалительных цитокинов IL также активирует транскрипт pln. В модели образования бляшек при болезни Альцгеймера на мышах ИЛ-1-альфа увеличивает экспрессию перлекана в ответ на повреждение головного мозга. Обработка IL-4 фибробластов десен человека в культуре приводила к увеличению продукции различных гепарансульфатных протеогликанов, включая перлекан. Обработка фибробластов легких человека in vitro IL-1-бета не приводила к какому-либо значительному увеличению продукции перлекана.
Другой сигнальный путь, способствующий усилению транскрипции pln, - это путь VEGF. Обработка VEGF165 эндотелиальных клеток микрососудов головного мозга человека в культуре стимулирует повышенную транскрипцию pln. Эта молекула является лигандом рецептора VEGF-2 (VGFR2), и кажется, что этот ответ VEGF165 специфичен для активации перлекана, что приводит к петле положительной обратной связи с участием фактора роста фибробластов (FGF), рецептора FGF (FGFR) и VEGFR2 в ответ. к повреждению эндотелия. Эта специфическая для микрососудов регуляция VEGF165 повышает вероятность того, что антикоагулянтная функция перлекана является частью процесса контроля повреждений в эндотелии головного мозга.
Передача сигналов протеинкиназы C предположительно ответственна за активацию транскрипции и трансляции определенных протеогликанов, включая перлекан. Когда эндоцитозный путь клеток HeLa ингибируется сверхэкспрессией мутантного динамина, активируется протеинкиназа C, и впоследствии увеличивается количество перлекана и белка. Напротив, обычное подавление перлекана в ответ на гипергликемию теряется у мышей, отрицательных по PKC-α.
Подавление транскрипции
Передача сигналов интерферона-γ опосредует репрессию транскрипции гена перлекана. Впервые это было показано в клеточных линиях рака толстой кишки, а затем в клеточных линиях другого тканевого происхождения, но в каждом случае для того, чтобы сигнал подействовал, требовался интактный фактор транскрипции STAT1. Это привело исследователей к мысли, что фактор транскрипции STAT1 взаимодействует с промотором Pln в дистальной области, локализованной на 660 пар оснований выше сайта начала транскрипции. Обработка интерфероном-γ эмбрионов мыши на стадии бластоцисты приводит к потере экспрессии перлекана на трофэктодерме и, таким образом, к эмбриональной морфологии и фенотипу в культуре клеток, что позволяет предположить, что эти обработанные интерфероном-γ бластоцисты будут дефектными при имплантации. Предположительно потеря экспрессии перлекана происходит из-за подавления транскрипции посредством активности фактора транскрипции STAT1, как показано ранее. Эти результаты in vitro не обязательно являются репрезентативными для нормальных физиологических концентраций интерферона-γ, и при этом цитокин обычно не экспрессируется широко, а вместо этого в очень специфические моменты времени развития. Важно отметить, что экспрессия перлекана может быть снижена обработкой экзогенным цитокином, таким как интерферон-γ, и если имело место физиологически аномальное увеличение экспрессии цитокина, это могло бы помешать имплантации.
Клеточные стрессоры и их влияние на экспрессию
Механический и химический стресс может повредить базальные мембраны или клетки, которые они поддерживают. Это может повлиять на профиль экспрессии генов клеток, особенно в их внеклеточном матриксе, который часто обеспечивает физическую поддержку и химический барьер для клеток. Гипоксия, воспаление, механический и химический стресс были изучены на предмет того, как они связаны с экспрессией перлекана.
Гипоксия - это состояние, обнаруживаемое при болезненных состояниях и во время травм, и часто приводит к недостаточной пролиферации эндотелиальных клеток. Это, а также роль перлекана в качестве эндорепеллина подтолкнули к одному исследованию природы регуляции экспрессии перлекана эндотелиальными клетками в условиях гипоксии. В условиях гипоксии это исследование показало, что экспрессия перлекана эндотелиальными клетками микрососудов сердца крысы была снижена на шестьдесят один процент по сравнению с нормальным контролем. Утверждение этой статьи состоит в том, что подавление перлекана ведет к потере активации FAK и, следовательно, к снижению передачи сигналов ERK, что приводит к снижению пролиферации клеток. Кажется нелогичным, что эндотелиальные клетки будут размножаться медленнее из-за потери перлекана и его субъединицы эндорепеллина. Возможно, эти эндотелиальные клетки просто подавляли транскрипцию многих генов в ответ на условия гипоксии. В другом исследовании гипоксия привела к индукции генов, связанных с апоптозом и гибелью клеток, но репрессия генов не ограничивалась белками, связанными с определенным путем. Когда эпителиальные клетки кишечника Т84 подвергаются воздействию гипоксии в течение 24 часов, происходит значительное увеличение мРНК перлекана и продукции белка. Они связывают это с тем фактом, что многие гены, повышенные в ответ на гипоксию, содержат в своем промоторе элемент ответа цАМФ (CRE), как и pln. Это различие между эндотелиальными клетками из исследования 2007 г. и эпителиальными клетками, изученными в этих экспериментах, указывает на то, насколько разнообразными могут быть механизмы регуляции перлекана в разных типах клеток.
Развитие бета-амилоидных бляшек в головном мозге связано с началом болезни Альцгеймера. Эти бляшки вызывают постоянное состояние воспаления в областях скопления, что приводит к экспрессии определенных продуктов генов, связанных с воспалением, некоторые из которых поддерживают воспаление в мозговом контексте. Как упоминалось ранее, для исследования влияния воспаления головного мозга на уровни экспрессии перлекана в мозге мышей создавали колотые раны, а после воспаления и различных периодов восстановления уровни мРНК и белка оценивали с помощью гибридизации in situ и иммуноокрашивания. Уровни перлекана были увеличены в гиппокампе, но не в полосатом теле во время периода заживления, наряду с экспрессией IL 1-альфа. Экспрессия перлекана была прослежена до клеток микроглии в гиппокампе и астроцитах. Эта роль перлекана в образовании бета-амилоидных бляшек подтверждается более ранним исследованием, показывающим, что обработка головного мозга крыс перлеканом и бета-амилоидом приводила к образованию сенильных бляшек, тогда как лечение одним бета-амилоидом не имело такого же эффекта.
На уровне организма механический стресс оказывает глубокое влияние на целостность внеклеточного матрикса и, вероятно, вызывает индукцию ряда генов ВКМ для репарации и ремоделирования ВКМ в тканевой строме и базальных мембранах. В одном исследовании изучалось влияние давления на глобальную транскрипцию генов in vitro с использованием микроматрицы и системы растяжения клеток, предназначенной для имитации внутриглазного давления в решетчатой пластинке (соединительной ткани) головки зрительного нерва. Их открытие состояло в том, что перлекан и несколько других протеогликанов были активированы в ответ на стимул растяжения. Также индуцировались TGF-β2 и VEGF, возможно, способствуя активации транскрипта и белка перлекана. Было показано, что аутокринная передача сигналов TGF-β является компенсаторным результатом механического стресса in vitro в эндотелиальных клетках. Используя аналогичный механизм растяжения клеток для имитации артериального давления, это исследование показало, что продукция перлекана увеличивается в ответ на механическое напряжение. Это зависит от аутокринной передачи сигналов TGF-β в петле положительной обратной связи с p38 и ERK. Это увеличение выработки эндотелиальными клетками ингибиторов роста VSMC (например, гепарина) обращено вспять в VSMC, где механический стресс вызывает пролиферацию. Деформация клеток VSMC в культуре приводит к усилению регуляции перлекана со значительным усилением сульфатирования гепарансульфатных цепей. Это не противоречит показанным данным, где экспрессия перлекана постоянна за пределами e19 в VSMC крыс, что позволяет предположить, что перлекан играет антипролиферативную роль в отношении VSMC. В этом случае, похоже, что сигнальная функция молекулы - это активный фактор активации, особенно из-за увеличения сульфатирования гепарансульфатных цепей.
Химическое повреждение органов может повлиять не только на генетическую и механическую целостность клетки, но и на внеклеточный матрикс ткани. Чтобы изучить влияние химического повреждения на клетки печени, крыс линии Wistar обрабатывали четыреххлористым углеродом в течение 48 часов перед умерщвлением. До лечения CCl 4 окрашивание перлекана ограничивалось желчным протоком и синусоидальными кровеносными сосудами печени. После лечения окрашивание перлекана было интенсивным в областях некроза. Это могло быть связано с увеличением капилляризации печени в попытке регенерировать поврежденную ткань. Аналогичные результаты были получены при лечении мышей ацетаменофином, когда перлекан и другие компоненты матрикса были сильно экспрессированы в некротических поражениях печени.
Экспрессия в культуре клеток
Одним из веских аргументов против достоверности результатов культивирования клеток in vitro на 2D пластиковых планшетах является то, что окружающая среда не точно отражает среду клеток в организме. Эта проблема решается путем разработки трехмерных клеточных культур с использованием широкого спектра субстратов в качестве каркасов или сред для клеток. В таких условиях экспрессия генов ЕСМ может более точно напоминать экспрессию нативного профиля экспрессии. 3D каркасы, структуры, на которых растут культивируемые клетки, могут состоять из других клеток, то есть сокультуры, синтетических полимеров, имитирующих естественную среду клеток, или очищенного ЕСМ, такого как матригель, и любой смеси этих трех компонентов.
Одна такая система была разработана для изучения развития кожи и образования базальной мембраны между кератиноцитами и стромой. Эта система используется для определения развития базальной мембраны между фибробластами в строме (в данном случае фибробластами в коллагеновом геле I типа) и кератиноцитами, выросшими на поверхности геля. Экспрессия перлекана и, следовательно, созревание базальной мембраны зависит от сшивания нидогеном цепи коллагена IV и γ1 ламинина в этой системе. Этот эффект также привел к отсутствию гемидесмосом в развивающейся ткани. Другая система, использующая гель неорганизованного гидратированного коллагена I, была использована для демонстрации того, что первичные фибробласты роговицы человека в конечном итоге проникают в гель и создают матрицу, состоящую из коллагена типа I и перлекана, а также нескольких других гликопротеинов сульфатированного матрикса. Это имитирует программу развития фибробластов роговицы in vivo и реакцию на повреждение.
Одной из долгосрочных целей создания систем трехмерных культур клеток является создание тканей, которые можно использовать в качестве заменителей для пациентов со многими типами заболеваний. В тканевых сердечных клапанах, созданных путем посева миофибробластов на коллаген типа I, за которым следуют эндотелиальные клетки, была подтверждена экспрессия гепарансульфат-протеогликана, хотя в этих тканях не было сделано различий между синдеканом и перлеканом. Еще одна процедура, которая может стать возможной с помощью тканевой инженерии, - это кератоэпителиопластика. Пересаженная ткань должна оставаться неповрежденной, для чего требуется предварительно сформированная базальная мембрана. Коллагеновые гели способствовали формированию полной базальной мембраны эпителиальными клетками роговицы в культуре.
Перлекан также может служить каркасом для посева клеток в культуру. Протоковые и ацинарные клетки слюнной железы человека были успешно выращены на биоактивном пептиде, содержащем последовательность, повторяющуюся в домене IV белка перлекана. Эти клетки воспроизводят ацинеподобные структуры, подобные тем, которые обнаруживаются в нативных железах и плотных контактах, а также полные базальные мембраны в культуре.
Ассоциация болезней
Рак
В то время как супрессия Perlecan вызывает существенное ингибирование роста опухоли и неоваскуляризации у нулевых мышей, напротив, когда перлекан-нулевые клетки вводят голым мышам, наблюдается усиленный рост опухоли по сравнению с контролем. Прогрессирование и патогенез рака тесно связаны с составом внеклеточного матрикса, а роль перлекана и других молекул внеклеточного матрикса при раке изучается большим количеством лабораторий. Поскольку базальная мембрана является первым препятствием на пути экстравазирования клеток карциномы, функции перлекана в этом процессе многочисленны. Одной модельной системой, используемой для изучения экспрессии перлекана в клеточных линиях карциномы, является система клеток с метастатической прогрессией меланомы MeWo / 70W. Клетки MeWo обычно менее инвазивны, чем их клональный вариант клеточной линии 70W. Одна лаборатория изучала экспрессию перлекана в 27 инвазивных меланомах, и 26 из 27 образцов показали значительное увеличение сообщения перлекана по сравнению с нормальной тканью тех же пациентов. Затем они использовали клеточные линии MeWo и 70W, чтобы изучить, изменилась ли экспрессия перлекана во время лечения нейротрофинами, которые могут стимулировать клеточную инвазию через матригель in vitro. Более инвазивные клетки 70W начали экспрессировать сообщение перлекана через десять минут после стимуляции нейротрофинами, а клетки MeWo не вырабатывали никаких сообщений pln независимо от лечения. Это исследование особо отметило тот факт, что активация перлекана произошла даже раньше, чем гепараназа, важный белок, участвующий в процессе экстравазации.
При раке яичников, как и при других формах рака, экспрессия перлекана происходит по-разному на протяжении прогрессирования заболевания. Окрашивание перлеканом теряется в базальной мембране яичника, поврежденной инвазивной аденокарциномой, в отличие от окрашивания перлеканом базальных мембран нормальных яичников и яичников с доброкачественными опухолями, где базальная мембрана однородна и очень похожа по составу на таковую в яичниках. другие нормальные ткани. Это согласуется с другими результатами, показывающими потерю перлекана в базальных мембранах, пораженных инвазивным раком шейки матки, распространяющимся на тазовые лимфатические узлы, что неудивительно из-за корреляции повышенных уровней экспрессии мРНК гепараназы с инвазией аналогичной карциномы шейки матки. Напротив, образование опухоли иммортализованной линии эпителиальных клеток мыши RT101, инъецированной крысам, зависело от экспрессии перлекана клетками мыши, а не от присутствия эндогенного перлекана крысы. Клетки RT101 с перлеканом, подавленным антисмысловым действием, не показали образования опухоли в этой системе, однако клетки, экспрессирующие антисмысловой перлекан и рекомбинантную конструкцию, кодирующую домены I, II и III мышиного перлекана, действительно показали образование опухоли. Таким образом, в этой системе действительно кажется, что экспрессия перлекана опухолевыми клетками необходима для агрегации опухоли. Дополнительные исследования модификации цепи GAG или основного белка инвазивными опухолевыми клетками по сравнению с доброкачественными опухолевыми клетками и нормальной тканью были бы информативными для лучшего понимания роли перлеканов в миграции рака.
Несколько лабораторий изучали ангиогенез опухолевых клеток in vitro с использованием антисмысловых конструкций к сообщению перлекана. Полноразмерная кДНК обратного комплемента, управляемая сильным промотором, трансфицируется в различные типы клеток для полного устранения экспрессии перлекана. Антисмысловые клетки карциномы толстой кишки блокируют трансляцию перлекана, что приводит к снижению роста опухоли и ангиогенеза. Аналогичное снижение пролиферации in vitro происходило в клетках NIH 3T3 и в линии клеток меланомы человека, экспрессирующих антисмысловую мРНК перлекана. Результаты in vitro с клеточными линиями саркомы Капоши показали, что потеря перлекана в результате трансфекции антисмысловой конструкцией привела к снижению пролиферации и миграции этого высокометастатического типа клеток. Эти результаты контрастируют с результатами in vivo с теми же линиями саркомы Капоши, которые показывают, что уменьшение количества перлекана приводит к усилению ангиогенеза, что облегчает миграцию и, таким образом, связано с увеличением степени злокачественности опухоли. Антисмысловой нокдаун перлекана в клеточных линиях фибросаркомы приводил к усилению роста и миграции как in vitro, так и in vivo. Эти данные о большем туморогенезе in vivo подтверждаются данными, показывающими, что С-конец белка перлекана действует как эндостатический модуль, ныне известный как эндорепеллин.
Конструкция рибозима была создана для использования в снижении уровней трансляции перлекана. Этот рибозим был нацелен на домен, кодирующий последовательность I белка перлекана. Он снижает экспрессию перлекана до 80% в линии клеток рака простаты C42B. В отличие от ранее обсуждавшихся исследований, эти клетки производили меньшие опухоли, чем их родительские клетки, при введении бестимусным мышам. Что это несоответствие результатов означает для инвазии, неизвестно, хотя верно, что перлекан является частью внеклеточного матрикса в мезенхимальной ткани, и клетки, претерпевающие эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП), могут активировать экспрессию перлекана как часть своего программирования ЭМП.
Диабет и сердечно-сосудистые заболевания
Уровни перлекана снижаются при многих болезненных состояниях, например, при диабете , атеросклерозе и артрите . Перлекан играет важную роль в поддержании барьера клубочковой фильтрации. Уменьшение количества перлекана в базальной мембране клубочков играет центральную роль в развитии диабетической альбуминурии . Экспрессия перлекана подавляется многими атерогенными стимулами, и поэтому считается, что перлекан играет защитную роль при атеросклерозе. Диабет и атеросклероз - часто ассоциированные синдромы. 80% смертей, связанных с диабетом, связаны с той или иной формой атеросклеротического осложнения, а базальная мембрана эндотелия участвует в атерогенном процессе. Было показано, что синтез гепарансульфата снижает в артериях диабетиков и в артериях, в которых развиваются атеросклеротические поражения.
Механизм подавления гепарансульфата в этих поражениях некоторое время оставался неизвестным. Одна теория утверждает, что высокое содержание глюкозы в кровотоке может привести к уменьшению прикрепления цепи GAG к перлекану, но не обязательно к изменению синтетического пути цепей GAG или основного белка. После обработки эндотелиальных клеток аорты человека средой с высоким содержанием глюкозы секретируемый перлекан содержал меньше включения сульфатов, сопровождаемое меньшим общим включением цепи GAG. Хотя не идентифицирован сигнальный путь, ведущий к этому снижению включения цепи GAG, предполагается, что потеря 30% общего гликозилирования белка может означать потерю одной из трех цепей HS на перлекане в этой модели гипергликемии, связанной с диабетом. Также отмечается, что подобное снижение внеклеточного HS без изменения окраски основных белковых цепей происходит в почках диабетиков и в клетках почек в культуре, обработанной высоким содержанием глюкозы.
Атеросклероз чаще всего является причиной ишемической болезни сердца и других сердечно-сосудистых заболеваний, а большая агрегация перлекана является симптомом прогрессирующих атеросклеротических бляшек. VSMC являются продуцентами перлекана в этом состоянии, а это означает, что большое количество исследований было сосредоточено на понимании средств усиления регуляции перлекана в этом состоянии. В тесте влияния циркулирующих неэтерифицированных жирных кислот (симптоматическое диабет и атерогенез) на экспрессию перлекана VSMC, экспрессия не изменилась по сравнению с контрольными клетками. Это контрастировало с 2-10-кратным увеличением экспрессии других протеогликанов базальной мембраны. Тромбин является еще одним маркером, связанным с атерогенезом и прокоагуляцией, и он избирательно увеличивает продукцию перлекана, но не других протеогликанов в VSMC человека в культуре. Предполагается, что этот эффект наблюдается только тогда, когда VSMC достигают слияния, но не до слияния. Эта концепция аналогична ранее упомянутым исследованиям, показывающим, что перлекан продуцируется VSMC только после того, как они прекратили размножение во время разработки. Другим маркером атеросклеротического пути является ангиотензин II, который также усиливает экспрессию перлекана в VSMC в культуре. Учитывая преобладание экспрессии перлекана при атеросклерозе, существует потенциал для терапии, основанной на экспрессии перлекана, и исследования могут в конечном итоге продолжаться в этом направлении.
Генетическое заболевание
Мутации в гене HSPG2 , который кодирует перлекан, вызывают диссегментарную дисплазию типа Сильвермана-Хэндмейкера и синдром Шварца-Джампеля .
Взаимодействия
Было показано, что Perlecan взаимодействует с
- FBLN2 ,
- FGF7 ,
- FGFBP1 и
- Транстиретин .
- FGF-2,
- FGF-18
использованная литература
внешние ссылки
- perlecan в Национальной медицинской библиотеке США по медицинским предметным рубрикам (MeSH)