Нервоводный канал - Nerve guidance conduit

Канал для наведения нервов (также называемый искусственным нервным проводником или искусственным нервным трансплантатом , в отличие от аутотрансплантата ) представляет собой искусственное средство направления роста аксонов для облегчения регенерации нервов и является одним из нескольких клинических методов лечения травм нервов . При прямом ушивание из двух культей отрезанного нерва не может быть достигнута без напряжения, стандартное клинического лечение периферических нервных травм аутологичного нерва прививка . Из-за ограниченной доступности донорской ткани и функционального восстановления при трансплантации аутологичного нерва исследования в области инженерии нервной ткани были сосредоточены на разработке биоискусственных проводников для направления нервов в качестве альтернативного лечения, особенно при больших дефектах. Подобные методы также исследуются для восстановления нервов в спинном мозге, но регенерация нервов в центральной нервной системе представляет большую проблему, потому что его аксоны не регенерируют в значительной степени в естественной среде.

Создание искусственных трубопроводов также известно как энтубуляция, потому что нервные окончания и промежуточная щель заключены в трубку, состоящую из биологических или синтетических материалов. Независимо от того, имеет ли канал форму биологической трубки, синтетической трубки или тканевого канала, он должен способствовать нейротропной и нейротрофической связи между проксимальным и дистальным концом нервной щели, блокировать внешние тормозящие факторы и обеспечивать физическое руководство для аксонов. отрастание. Самая основная цель проводника для наведения нервов - объединить физические, химические и биологические сигналы в условиях, которые будут способствовать формированию ткани.

Материалы, которые использовались для изготовления биологических трубок, включают кровеносные сосуды и скелетные мышцы, в то время как неабсорбируемые и биоабсорбируемые синтетические трубки были сделаны из силикона и полигликолида соответственно. Созданные тканевой инженерией каналы для направления нервов представляют собой комбинацию многих элементов: структуры каркаса, материала каркаса, клеточной терапии, нейротрофических факторов и биомиметических материалов. Выбор того, какие физические, химические и биологические сигналы использовать, основан на свойствах нервной среды, которая имеет решающее значение для создания наиболее желательной среды для регенерации аксонов. Факторы, которые контролируют выбор материала, включают биосовместимость , биоразлагаемость , механическую целостность, управляемость во время роста нервов, имплантации и стерилизации.

Топография лесов

В тканевой инженерии рассматриваются три основных уровня структуры каркаса:

  • надстройка, общая форма подмостей;
  • микроструктура, ячеистая структура поверхности; а также
  • наноструктура, структура субклеточного уровня поверхности.

Надстройка

Надстройка трубопровода или каркаса важна для моделирования in vivo условий формирования нервной ткани. Внеклеточный матрикс, который в основном отвечает за направление роста и формирования ткани, имеет сложную надстройку, созданную множеством переплетенных волокнистых молекул. Способы формирования искусственной надстройки включают использование термочувствительных гидрогелей, продольно ориентированных каналов, продольно ориентированных волокон, растянутых аксонов и нановолоконных каркасов.

Термочувствительные гидрогели

При черепно-мозговой травме (ЧМТ) инициируется серия повреждающих событий, которые приводят к гибели клеток и общей дисфункции, что вызывает образование полости повреждения неправильной формы. Образовавшаяся полость вызывает множество проблем для каркасов тканевой инженерии, поскольку требуется инвазивная имплантация, и часто каркас не соответствует форме полости. Чтобы обойти эти трудности, были разработаны термочувствительные гидрогели, которые претерпевают переходы раствор-гелеобразование (золь-гель), которые вызваны разницей в комнатных и физиологических температурах, чтобы облегчить имплантацию посредством гелеобразования in situ и придания формы полости. вызвано, что позволяет вводить их минимально инвазивным способом.

Метилцеллюлоза (MC) - это материал с четко выраженными переходами золь-гель в оптимальном диапазоне температур. Гелеобразование MC происходит из-за усиления внутри- и межмолекулярных гидрофобных взаимодействий при повышении температуры. Переход золь-гель определяется более низкой критической температурой раствора (НКТР), которая является температурой, при которой модуль упругости равен модулю вязкости. НКТР не должна превышать физиологическую температуру (37 ° C), если каркас должен образовывать гель при имплантации, создавая минимально инвазивную доставку. После имплантации в полость поражения TBI или в канал для направления периферических нервов MC вызывает минимальную воспалительную реакцию. Для минимально инвазивной доставки также очень важно, чтобы раствор MC имел вязкость при температурах ниже его НКТР, что позволяет вводить его через иглу небольшого калибра для имплантации в приложениях in vivo . MC успешно использовался в качестве агента доставки для интраоптической и пероральной фармацевтической терапии. Некоторые недостатки MC включают его ограниченную склонность к адсорбции белка и адгезии нейронных клеток, что делает его небиоактивным гидрогелем. Из-за этих недостатков использование MC для регенерации нервной ткани требует присоединения биологически активной группы к основному полимеру для усиления клеточной адгезии.

Другой термочувствительный гель - это гель, который образуется путем объединения хитозана с солью глицерофосфата (GP). Этот раствор загустевает при температуре выше 37 ° C. Гелеобразование хитозана / GP происходит довольно медленно: для первоначального застывания требуется полчаса и еще 9 часов для полной стабилизации. Прочность геля варьируется от 67 до 1572 Па в зависимости от концентрации хитозана; нижний предел этого диапазона приближается к жесткости ткани мозга. Хитозан / GP показал успех in vitro , но добавление полилизина необходимо для усиления прикрепления нервных клеток. Полилизин был ковалентно связан с хитозаном, чтобы предотвратить его диффузию. Полилизин был выбран из-за его положительной природы и высокой гидрофильности, которая способствует росту нейритов . Выживаемость нейронов увеличилась вдвое, хотя рост нейритов не изменился при добавлении полилизина.

Продольно ориентированные каналы

Продольно ориентированные каналы представляют собой макроскопические структуры, которые могут быть добавлены к каналу, чтобы дать регенерирующим аксонам четко определенную направляющую для роста прямо вдоль каркаса. В каркасе с архитектурой микротрубочковых каналов регенерирующие аксоны способны проходить через открытые продольные каналы, как они обычно проходят через эндоневральные трубки периферических нервов. Кроме того, каналы увеличивают площадь поверхности, доступную для контакта с клетками. Каналы обычно создаются путем введения иглы, проволоки или второго раствора полимера в полимерный каркас; после стабилизации формы основного полимера иглу, проволоку или второй полимер удаляют, чтобы сформировать каналы. Обычно создается несколько каналов; однако каркас может состоять только из одного большого канала, который представляет собой просто одну полую трубу.

Техника формовки была создана Wang et al. для формирования канала для наведения нервов с многоканальным внутренним матриксом и внешней стенкой трубки из хитозана. В своем исследовании 2006 года Wang et al. продевают иглы для акупунктуры через полую хитозановую трубку, где они удерживаются на месте путем фиксации на обоих концах пластырей, созданных с помощью CAD. Затем в трубку вводят раствор хитозана, который затвердевает, после чего иглы удаляются, создавая продольно ориентированные каналы. Затем был создан репрезентативный каркас для характеристики с 21 каналом с использованием игл для акупунктуры диаметром 400 мкм. При исследовании под микроскопом было обнаружено, что каналы имеют приблизительно круглую форму с небольшими неровностями; все каналы были выровнены по внутреннему диаметру внешней стенки трубы. Микро-КТ подтвердила, что каналы проходят по всей длине каркаса. Под действием водопоглощения внутренний и внешний диаметры каркаса становились больше, но диаметры каналов существенно не менялись, что необходимо для поддержания формы каркаса, которая направляет расширение нейритов. Внутренняя структура обеспечивает увеличение прочности на сжатие по сравнению с одной только полой трубкой, что может предотвратить обрушение каркаса на растущие нейриты. Клетки Neuro-2a могли расти на внутренней матрице каркаса, и они ориентировались вдоль каналов. Хотя этот метод был протестирован только на хитозане, его можно адаптировать к другим материалам.

процесс лиофилизации и нагрева проволокой - еще один метод создания продольно ориентированных каналов, разработанный Huang et al. (2005). Раствор хитозана и уксусной кислоты замораживали вокруг никель-медных (Ni-Cu) проводов в ловушке с жидким азотом ; впоследствии провода были нагреты и удалены. Провода Ni-Cu были выбраны из-за их высокого уровня сопротивления. Лиофилизаторы с контролируемой температурой использовали для возгонки уксусной кислоты. Не было никаких свидетельств слияния или разделения каналов. После лиофилизации размеры каркаса уменьшились, в результате чего каналы стали немного меньше используемой проволоки. Каркасы нейтрализовали до физиологического значения pH с использованием основания, которое оказало сильное влияние на пористую структуру. Более слабые основания сохраняли однородность пористой структуры, но более сильные основания делали ее неконтролируемой. Используемая здесь техника может быть немного изменена для работы с другими полимерами и растворителями.

Другой способ создания продольно ориентированных каналов - это создание канала из одного полимера с заделанными продольно ориентированными волокнами из другого полимера; затем выборочно растворяют волокна с образованием продольно ориентированных каналов. Волокна поликапролактона (PCL) заключали в каркас (гидроксиэтил) метакрилат (HEMA). PCL был выбран вместо поли (молочной кислоты) (PLA) и сополимера молочной и гликолевой кислоты (PLGA), поскольку он нерастворим в HEMA, но растворим в ацетоне . Это важно, потому что HEMA использовался в качестве основного материала трубопровода, а ацетон использовался для избирательного растворения полимерных волокон. Экструдированные волокна PCL вставляли в стеклянную трубку и вводили раствор HEMA. Количество созданных каналов было постоянным от партии к партии, и различия в диаметре волокна можно было уменьшить, создав более контролируемую систему экструзии волокна PCL. Было подтверждено, что сформированные каналы являются непрерывными и однородными при исследовании изменений пористости. Этот процесс безопасен, воспроизводим и имеет контролируемые размеры. В аналогичном исследовании, проведенном Yu и Shoichet (2005), HEMA сополимеризовали с AEMA для создания геля P (HEMA-co-AMEA). Волокна поликапролактона (PCL) были внедрены в гель, а затем выборочно растворены ацетоном с обработкой ультразвуком для создания каналов. Было обнаружено, что HEMA в смеси с 1% AEMA создает самые прочные гели. По сравнению с каркасами без каналов добавление 82–132 каналов может обеспечить примерно 6–9-кратное увеличение площади поверхности, что может быть полезно для исследований регенерации, которые зависят от опосредованных контактом сигналов.

Ито и др. (2003) разработали каркас, состоящий из одного большого продольно ориентированного канала, созданного с использованием хитозановых сухожилий крабов. Сухожилия собирали у крабов (Macrocheira kaempferi) и многократно промывали раствором гидроксида натрия для удаления белков и деацетилирования хитина сухожилий , который впоследствии стал известен как хитозан сухожилий. Брусок из нержавеющей стали с треугольным поперечным сечением (каждая сторона длиной 2,1 мм) вставляли в полую жильную хитозановую трубку круглого сечения (диаметр: 2 мм; длина: 15 мм). При сравнении трубок круглой и треугольной формы было обнаружено, что треугольные трубки имели улучшенную механическую прочность, лучше сохраняли свою форму и увеличивали доступную площадь поверхности. Хотя это эффективный метод создания единственного канала, он не обеспечивает такой большой площади поверхности для роста клеток, как многоканальные каркасы.

Newman et al. (2006) вставляли проводящие и непроводящие волокна в каркас коллаген-TERP (коллаген, поперечно связанный с терполимером поли (N-изопропилакриламида) (PNiPAAm)). Волокна встраивали, плотно оборачивая их на маленькое предметное стекло и помещая раствор коллагена-TERP между ним и другим предметным стеклом; прокладки между предметными стеклами устанавливают толщину геля 800 мкм. Проводящими волокнами были углеродное волокно и кевлар , а непроводящими волокнами - нейлон-6 и вольфрамовая проволока. Нейриты распространяются во всех направлениях толстыми пучками на углеродном волокне; однако с другими тремя волокнами нейриты расширяются в тонких тканеподобных формах. Нейриты не показали направленного роста на углеродных и кевларовых волокнах, но они выросли вдоль волокон нейлона-6 и в некоторой степени вдоль вольфрамовой проволоки. В вольфрамовой проволоке и каркасах из волокон из нейлона-6 нейриты врастали в гель рядом с границей раздела волокно-гель в дополнение к росту вдоль поверхности. Все гели с волокнами, кроме кевлара, показали значительное увеличение роста нейритов по сравнению с гелями без волокон. Не было никакой разницы в разрастании нейритов между непроводящими и проводящими волокнами.

В своем исследовании 2005 года Cai et al. добавлены микрофиламенты из поли (L-молочной кислоты) (PLLA) в полые поли (молочная кислота) (PLA) и силиконовые трубки. Характеристики направления микроволокна были обратно пропорциональны диаметру волокна с меньшими диаметрами, способствующими лучшей продольно ориентированной миграции клеток и регенерации аксонов. Микроволокна также способствовали миелинизации во время восстановления периферических нервов.

Растянутые аксоны

Было продемонстрировано, что зрелые тракты аксонов растут при механическом растяжении в центральной части цилиндра аксона. Такое механическое растяжение применялось с помощью специального биореактора для растяжения-растяжения аксонов, состоящего из четырех основных компонентов: специально разработанной камеры расширения аксонов, стола линейного перемещения, шагового двигателя и контроллера. Культура нервной ткани помещается в камеру расширения с портом для газообмена и съемной растягивающейся рамкой, которая способна разделять две группы сом (тела нейронных клеток) и, таким образом, растягивать их аксоны. Коллагеновый гель использовался для стимулирования роста более крупных трактов аксонов, которые были видны невооруженным глазом. Есть две причины усиления роста из-за коллагенового покрытия: 1) культура стала гидрофобной после высыхания коллагена, что позволило более плотной концентрации нейронов расти, и 2) коллагеновое покрытие создало беспрепятственное покрытие на двух субстратах для удлинения. . Исследование с помощью сканирующего электронного микроскопа и ПЭМ не показало признаков истончения аксонов из-за растяжения, а цитоскелет оказался нормальным и неповрежденным. Выращенные тракты аксонов культивировали на биосовместимой мембране, которая могла быть непосредственно сформирована в цилиндрическую структуру для трансплантации, устраняя необходимость переносить аксоны на каркас после завершения роста. Выращенные аксоны смогли расти с беспрецедентной скоростью 1 см / день всего за 8 дней акклиматизации, что намного превышает максимальную скорость роста 1 мм / день, измеренную для расширения конуса роста. Скорость 1 мм / день также является средней скоростью переноса структурных элементов, таких как нейрофиламенты.

Каркасы из нановолокон

Исследования наноразмерных волокон пытаются имитировать внеклеточную среду in vivo , чтобы способствовать направленному росту и регенерации. Три различных метода формирования нановолоконных каркасов - это самосборка, разделение фаз и электроспиннинг. Однако существует множество других методов формирования каркасов из нановолокна.

Самосборка нановолоконных каркасов возможна только тогда, когда сами волокна спроектированы для самосборки. Одним из распространенных способов управления самосборкой волокон каркаса является использование амфифильных пептидов, так что в воде гидрофобная составляющая управляет самосборкой. Тщательно рассчитанная инженерия амфифильных пептидов позволяет точно контролировать самособирающийся матрикс. Самостоятельная сборка позволяет создавать как упорядоченные, так и неупорядоченные топографии. Филлипс и др. (2005) разработана и испытаны в пробирке и в естественных условиях самостоятельного выровнен коллаген - клетки Шванновских матрицах, что позволило DRG нейритов выравнивания расширения в пробирке . Коллагеновые гели широко используются в качестве субстратов для трехмерных культур тканей . Клетки способны образовывать опосредованные интегрином соединения с коллагеном, который инициирует сборку цитоскелета и подвижность клеток. Когда клетки движутся по коллагеновым волокнам, они создают силы, сжимающие гель. Когда волокна коллагена привязаны к обоим концам, силы, генерируемые клетками, создают одноосное напряжение, заставляя клетки и волокна коллагена выравниваться. Преимущества этой матрицы - простота и скорость приготовления. Растворимый фибронектин плазмы также может самособираться в стабильные нерастворимые волокна при воздействии прямого механического сдвига в вязком растворе. Филлипс и др. (2004) исследовали новый метод сдвиговой агрегации, который вызывает улучшенную агрегацию. Механическое разрезание создавали путем вытягивания болюса 0,2 мл на 3 см с помощью щипцов; фибронектин объединяется в нерастворимые волокна на быстро движущейся границе раздела в ячейке для ультрафильтрации. Предлагаемый механизм такой агрегации волокон - это удлинение и удлинение белка под действием механической силы сдвига, что приводит к латеральной упаковке и агрегации белков в волокнах. Филлипс и др. показали, что механический сдвиг, вызванный растяжением высоковязкого геля фибронектина, вызывает существенные изменения в его структуре и что при нанесении посредством одноосного растяжения вязкий гель фибронектина образует ориентированные волокнистые агрегаты фибронектина; кроме того, волокнистые агрегаты обладают пониженной растворимостью и могут поддерживать различные типы клеток in vitro.

Разделение фаз позволяет создавать трехмерные субмикрометровые волокнистые каркасы без использования специального оборудования. Пять этапов фазового разделения - это растворение полимера, фазовое разделение и гелеобразование, экстракция растворителем из геля, замораживание и сублимационная сушка в воде. Конечный продукт - это непрерывная волоконная сеть. Разделение фаз можно модифицировать для соответствия многим различным применениям, а структуру пор можно изменять с помощью различных растворителей, что может изменить весь процесс с жидкого-жидкого на твердое-жидкое. Пористость и диаметр волокна также могут быть изменены путем изменения начальной концентрации полимера; более высокая начальная концентрация приводит к меньшему количеству пор и большему диаметру волокон. Этот метод можно использовать для создания сетей волокон с диаметром, достигающим диаметра коллагеновых волокон типа I. Созданная волокнистая сеть ориентирована случайным образом, и до сих пор не проводилось никаких работ по организации волокон. Разделение фаз - широко используемый метод для легкого создания высокопористых нановолоконных каркасов.

Электроспиннинг обеспечивает надежную платформу для разработки синтетических проводников для направления нервов. Электропрядение может служить для создания каркасов контролируемых размеров с различным химическим составом и топографией. Кроме того, в волокна могут быть заключены различные материалы, включая частицы, факторы роста и даже клетки. Электропрядение создает волокна путем электрического заряда капли полимерного расплава или раствора и подвешивания ее в капилляре. Затем к одному концу капилляра прикладывается электрическое поле до тех пор, пока заряд не превысит поверхностное натяжение, создавая полимерную струю, которая удлиняется и истончается. Эта полимерная струя выходит в виде конуса Тейлора, оставляя после себя электрически заряженные полимеры, которые собираются на заземленной поверхности в качестве растворителя по мере того, как растворитель испаряется из струй. Волокна были спрядены с диаметром от менее 3 нм до более 1 мкм. На процесс влияют параметры системы, такие как тип полимера, молекулярная масса полимера и свойства раствора, а также параметры процесса, такие как скорость потока, напряжение, диаметр капилляра, расстояние между коллектором и капилляром и движение коллектора. Созданная волокнистая сетка неупорядочена и имеет высокое отношение поверхности к объему в результате высокой пористости; большая площадь поверхности сети идеальна для роста и транспортировки отходов и питательных веществ при инженерии нервных тканей. Две особенности электроспрядных каркасов, которые полезны для инженерии нервной ткани, - это морфология и архитектура, которые близко имитируют ECM, и поры, которые представляют собой правильный диапазон размеров, который обеспечивает обмен питательными веществами, но предотвращает рост глиальной рубцовой ткани (около 10 мкм). Было продемонстрировано, что случайные электроспряденные каркасы из PLLA обладают повышенной адгезией клеток, что может быть связано с повышенной шероховатостью поверхности. Было также показано, что химически модифицированные маты из электропряденого волокна влияют на дифференцировку нервных стволовых клеток и увеличивают пролиферацию клеток. За последнее десятилетие ученые также разработали многочисленные методы производства выровненных каркасов из нановолокон, которые служат для предоставления клеткам дополнительных топографических сигналов. Это выгодно, потому что крупномасштабные трехмерные выровненные каркасы не могут быть легко созданы с использованием традиционных технологий изготовления. В исследовании, проведенном Yang et al. (2005) были созданы, охарактеризованы и сравнены выровненные и неупорядоченные структуры из микроволоконных и нановолоконных электроспряд из поли (L-молочной кислоты) (PLLA). Диаметр волокна был прямо пропорционален исходной концентрации полимера, используемой для электропрядения; средний диаметр выровненных волокон был меньше, чем у случайных волокон при идентичных условиях обработки. Было показано, что нервные стволовые клетки вытянуты параллельно выровненным электропряденым волокнам. Выровненные нановолокна имели более длинную среднюю длину нейритов по сравнению с выровненными микроволокнами, случайными микроволокнами и случайными нановолокнами. Кроме того, на выровненных нановолокнах дифференцировалось больше клеток, чем на выровненных микроволокнах. Таким образом, результаты этого исследования показали, что выровненные нановолокна могут быть более полезными, чем невыровненные волокна или микроволокна, для стимуляции регенерации нервов.

Микроструктура и наноструктура

Микроструктура и наноструктура, наряду с надстройкой, представляют собой три основных уровня структуры каркаса, которые заслуживают рассмотрения при создании топографии каркаса. В то время как надстройка относится к общей форме каркаса, микроструктура относится к структуре клеточного уровня поверхности, а наноструктура относится к структуре субклеточного уровня поверхности. Все три уровня структуры способны вызывать клеточные ответы; однако существует значительный интерес к реакции клеток на наноразмерную топографию, мотивированную наличием множества наноразмерных структур внутри внеклеточного матрикса. Растет число методов производства микро- и наноструктур (многие из которых происходят из полупроводниковой промышленности), позволяющих создавать различные топографии с контролируемым размером, формой и химическим составом.

Физические подсказки

Физические подсказки формируются путем создания упорядоченной поверхностной структуры на уровне микроструктуры и / или наноструктуры. Было показано, что физические сигналы на наноуровне модулируют клеточную адгезию, миграцию, ориентацию, контактное ингибирование, экспрессию генов и формирование цитоскелета. Это позволяет управлять клеточными процессами, такими как пролиферация, дифференцировка и распространение. Существует множество методов создания микро- и наноразмерных топографий, которые можно разделить на те, которые создают упорядоченные топографии, и те, которые создают неупорядоченные топографии.

Упорядоченные топографии определяются как шаблоны, которые организованы и геометрически точны. Хотя существует множество методов создания упорядоченных топографий, они обычно требуют много времени, навыков и опыта, а также использования дорогостоящего оборудования.

Фотолитография включает экспонирование источника света на кремниевой пластине, покрытой фоторезистом; маска с желаемым рисунком помещается между источником света и пластиной, тем самым избирательно позволяя свету просачиваться и создавать узор на фоторезисте . Дальнейшая разработка пластины позволяет выявить узор на фоторезисте. Фотолитография, выполняемая в ближнем УФ-диапазоне, часто рассматривается как стандарт для создания топографий в микромасштабе. Однако, поскольку нижний предел размера является функцией длины волны, этот метод нельзя использовать для создания наноразмерных элементов. В своем исследовании 2005 года Mahoney et al. Созданные организованные массивы полиимидных каналов (11 мкм в высоту и 20–60 мкм в ширину) были созданы на стеклянной подложке с помощью фотолитографии. Полиимид был использован потому, что он хорошо прилипает к стеклу, химически стабилен в водном растворе и биосовместим. Предполагается, что микроканалы ограничивают диапазон углов, под которыми цитоскелетные элементы внутри конусов роста нейритов могут накапливаться, собираться и ориентироваться. Было значительное уменьшение количества нейритов, выходящих из сомы; тем не менее, уменьшение было меньше, поскольку диапазон углов, на которых выходили нейриты, увеличивался. Кроме того, нейриты были в среднем в два раза длиннее, когда нейроны культивировали на микроканалах, по сравнению с контролем на плоской поверхности; это могло быть связано с более эффективным выравниванием нитей.

В электронно-лучевой литографии (EBL) электронно-чувствительный резист подвергается воздействию пучка электронов высокой энергии. Есть выбор резиста положительного или отрицательного типа; однако более низкое разрешение элемента может быть получено с отрицательными резистами. Узоры создаются путем программирования пучка электронов на точный путь вдоль поверхности материала. На разрешение влияют другие факторы, такие как рассеяние электронов в резисте и обратное рассеяние от подложки. EBL может создавать отдельные поверхностные элементы размером порядка 3–5 нм. Если требуется несколько элементов на большой площади поверхности, как в случае тканевой инженерии, разрешение падает, и элементы могут быть созданы только на 30–40 нм, и проявление резиста начинает оказывать большее влияние на формирование рисунка. Чтобы предотвратить растворение резиста, можно использовать ультразвуковое перемешивание для преодоления межмолекулярных сил. Кроме того, изопропиловый спирт (IPA) помогает создавать матрицы высокой плотности. EBL может стать более быстрым и менее затратным процессом за счет воспроизведения нанометрового рисунка в полимерных материалах; Процесс репликации был продемонстрирован с поликапролактоном (PCL) с использованием горячего тиснения и литья в растворителе . В исследовании, проведенном Gomez et al. (2007) было показано, что микроканалы шириной 1 и 2 мкм и глубиной 400 и 800 нм, созданные EBL на PDMS, усиливают образование аксонов в клетках гиппокампа в культуре в большей степени, чем иммобилизованные химические сигналы.

Рентгеновская литография - это еще один метод формирования упорядоченных паттернов, который можно использовать для исследования роли, которую топография играет в стимулировании нейритогенеза. Параметры маски определяют периодичность рисунка, но ширина и глубина гребня определяются условиями травления. В исследовании были созданы гребни с периодами от 400 до 4000 нм, шириной от 70 до 1900 нм и глубиной канавки 600 нм; развивающиеся нейриты продемонстрировали контактное наведение с элементами размером всего 70 нм, и более 90% нейритов находились в пределах 10 градусов параллельного выравнивания с гребнями и бороздками. Не было существенной разницы в ориентации по отношению к используемым размерам элементов. Количество нейритов на клетку ограничивалось гребнями и бороздками, производя скорее биполярный, чем ветвящийся фенотип.

Неупорядоченные топографии обычно создаются процессами, которые происходят спонтанно во время другой обработки; шаблоны имеют случайную ориентацию и организацию с неточным контролем или отсутствием контроля над геометрией элемента. Преимущество создания неупорядоченных топографий по сравнению с упорядоченными заключается в том, что процессы зачастую менее трудоемки, менее дороги и не требуют больших навыков и опыта. Неупорядоченные топографии могут быть созданы путем расслоения полимеров, коллоидной литографии и химического травления.

При расслоении полимеров смеси полимеров испытывают спонтанное фазовое разделение; это часто происходит в таких условиях, как центробежное литье на кремниевые пластины. Элементы, которые могут быть созданы с помощью этого метода, включают наноразмерные ямки, островки и ленты, которыми можно в определенной степени управлять, регулируя соотношение и концентрацию полимера для изменения формы и размера элемента, соответственно. В горизонтальном направлении нет особого контроля, хотя вертикальное направление элементов можно точно контролировать. Поскольку узор очень неупорядочен по горизонтали, этот метод может использоваться только для изучения взаимодействия клеток с нанотопографией определенной высоты .

Коллоидная литография недорога и может использоваться для создания поверхностей с контролируемой высотой и диаметром. Наноколонки используются в качестве маски для травления, распределяя их по поверхности материала, а затем используются бомбардировка ионным пучком или испарение пленки для травления вокруг наноколонок, создавая наностолбцы и наноямки соответственно. Конечную структуру поверхности можно контролировать, варьируя площадь, покрытую коллоидами, и размер коллоида. Площадь, покрываемую коллоидами, можно изменить, изменив ионную силу коллоидного раствора. Этот метод позволяет создавать большие участки поверхности с рисунком, что необходимо для тканевой инженерии.

Химическое травление включает замачивание поверхности материала в травителе, таком как фтористоводородная кислота (HF) или гидроксид натрия (NaOH), до тех пор, пока поверхность не протравится до желаемой шероховатости, создаваемой ямками и выступами в нанометровом масштабе. Более длительное время травления приводит к получению более шероховатой поверхности (т. Е. Меньшего размера ямок и выступов на поверхности). Структуры с определенной геометрией или организацией не могут быть созданы этим элементарным методом, потому что в лучшем случае его можно рассматривать как обработку поверхности для изменения шероховатости поверхности. Существенными преимуществами этого метода являются простота использования и низкая стоимость создания поверхности с нанотопографией . Кремниевые пластины были протравлены с использованием HF, и было продемонстрировано, что адгезия клеток увеличивалась только в определенном диапазоне шероховатостей (20–50 нм).

Химические подсказки

Помимо создания топографии с помощью физических сигналов, его можно создать с помощью химических сигналов путем выборочного нанесения раствора полимера в виде узоров на поверхность подложки. Существуют разные методы нанесения химических сигналов. Два метода дозирования химических растворов включают нанесение полосок и пьезоэлектрическое микродозирование.

Полимерные пленки с полосатым рисунком могут быть сформированы на твердых подложках путем заливки разбавленного раствора полимера. Этот метод относительно простой, недорогой и не имеет ограничений по материалам каркасов, которые можно использовать. Процедура включает горизонтальное перекрытие стеклянных пластин, при этом их вертикально разделяет узкая щель, заполненная раствором полимера. Верхняя пластина перемещается с постоянной скоростью от 60 до 100 мкм / с. Тонкая жидкая пленка раствора непрерывно образуется на краю скользящего стекла после испарения растворителя. Полосы, полученные на скоростях 60, 70 и 100 мкм / с, создавали ширину и расстояние между канавками 2,2 и 6,1 мкм, 3,6 и 8,4 мкм, а также 4,3 и 12,7 мкм соответственно; диапазон высот гребней составлял 50–100 нм. Цурума, Танака и др. продемонстрировали, что эмбриональные нервные клетки культивируются на пленке, покрытой прикрепленным поли-L-лизином и вытянутыми параллельно полосам поли (ε-капролактон) / раствор хлороформа (1 г / л) с узкой шириной рисунка и промежутком (ширина: 2,2 мкм, расстояние: 6,1 мкм). Однако нейроны росли поперек оси паттернов с большой шириной и расстоянием (ширина: 4,3 мкм, расстояние: 12,7 мкм). В среднем нейроны на пленках с полосатым рисунком имели меньше нейритов на клетку и более длинные нейриты по сравнению с нейронами на пленках без рисунка. Таким образом, параметры рисунка полос могут определять направление роста, длину нейритов и количество нейритов на клетку.

Микродозирование использовалось для создания микрорельефов на чашках для культивирования из полистирола путем дозирования капель адгезивного ламинина и неклейких растворов бычьего сывороточного альбумина (БСА). Микродиспенсер представляет собой пьезоэлектрический элемент, прикрепленный к толкателю наверху канала, протравленного в кремнии, который имеет по одному входу на каждом конце и сопло посередине. Пьезоэлектрический элемент расширяется при приложении напряжения, вызывая выдачу жидкости через сопло. Микродозатор перемещается с помощью координатно-координатного стола с компьютерным управлением. Разрешение микрорельефа зависит от многих факторов: вязкости распределяемой жидкости, шага капель (расстояния между центром двух соседних капель в строке или массиве) и подложки. С увеличением вязкости линии становятся тоньше, но если вязкость жидкости слишком высока, жидкость не может быть вытеснена. Нагревание раствора создает более однородные белковые линии. Хотя для создания непрерывных линий необходимо некоторое перекрытие капель, неравномерное испарение может вызвать неравномерную концентрацию белка вдоль линий; этого можно избежать за счет более плавного испарения, изменив свойства распределяемого раствора.

Для паттернов, содержащих 0,5 мг / мл ламинина, на микродисперсных линиях росла более высокая доля нейритов, чем между линиями. На образцах белка BSA 10 мг / мл и 1 мг / мл и образцах белка BSA без жирных кислот значительное количество нейритов избегало белковых линий и росло между линиями. Таким образом, линии BSA, содержащие жирные кислоты, были столь же непроницаемыми для роста нейритов, как и линии, содержащие BSA с жирными кислотами. Поскольку микродозирование не требует прямого контакта с поверхностями подложки, этот метод позволяет использовать поверхности с тонкой микро- или нанотопологией, которые могут быть разрушены при контакте. Количество депонированного белка можно варьировать, дозируя большее или меньшее количество капель. Преимущество микродозирования заключается в том, что рисунки можно создавать быстро за 5–10 минут. Поскольку пьезоэлектрический микродозатор не требует нагрева, можно распределять термочувствительные белки и жидкости, а также живые клетки.

Материал строительных лесов

Выбор материала строительных лесов - это, пожалуй, самое важное решение, которое необходимо принять. Он должен быть биосовместимым и биоразлагаемым; кроме того, он должен иметь возможность включать любые желаемые физические, химические или биологические сигналы, что в случае некоторых химических сигналов означает, что он должен иметь доступный сайт для химического связывания пептидов и других молекул. Материалы каркаса, выбираемые для нервных проводников, почти всегда представляют собой гидрогели. Гидрогель может состоять из биологических или синтетических полимеров. И биологические, и синтетические полимеры имеют свои сильные и слабые стороны. Важно отметить, что материал трубопровода может вызвать неадекватное восстановление, когда (1) скорости деградации и резорбции не соответствуют скорости образования ткани, (2) характеристики напряжения и деформации плохо сравниваются со свойствами нервной ткани, (3) когда происходит деградирующее набухание, вызывающее значительную деформацию, (4) возникает сильная воспалительная реакция или (5) материал имеет низкую проницаемость.

Гидрогель

Гидрогели - это класс биоматериалов, которые представляют собой химически или физически сшитые водорастворимые полимеры. Они могут быть разлагаемыми или неразлагаемыми, в зависимости от их химического состава, но разлагаемые более желательны, когда это возможно. Гидрогели для целей тканевой инженерии вызывают большой интерес, поскольку они, как правило, обладают высокой биосовместимостью, механическими свойствами, подобными мягким тканям, и способностью вводиться в виде гелеобразной жидкости. Когда гидрогели физически сшиты, они должны полагаться на разделение фаз для гелеобразования; фазовое разделение зависит от температуры и является обратимым. Некоторые другие преимущества гидрогелей заключаются в том, что они используют только нетоксичные водные растворители, позволяют вливать питательные вещества и выводить продукты жизнедеятельности, а также позволяют клеткам спонтанно собираться. Гидрогели имеют низкое межфазное натяжение, что означает, что клетки могут легко мигрировать через границу ткани и имплантата. Однако с помощью гидрогелей трудно сформировать широкий диапазон механических свойств или структур с контролируемым размером пор.

Синтетический полимер

Синтетический полимер может быть не разлагаемые или разрушаемой. Для инженерии нервной ткани предпочтительны разлагаемые материалы, когда это возможно, потому что долгосрочные эффекты, такие как воспаление и рубцы, могут серьезно повредить нервную функцию. Скорость разложения зависит от молекулярной массы полимера, его кристалличности и соотношения субъединиц гликолевой кислоты и молочной кислоты. Из - за метильной группой , молочная кислота является более гидрофобной , чем гликолевая кислота вызывает его гидролиз медленнее. Синтетические полимеры обладают более гибкими механическими свойствами и скоростью разложения, которую можно контролировать в широком диапазоне, и они устраняют беспокойство об иммуногенности. В настоящее время в инженерии нервной ткани используется множество различных синтетических полимеров. Однако недостатки многих из этих полимеров включают отсутствие биосовместимости и биоактивности, что не позволяет этим полимерам способствовать прикреплению, пролиферации и дифференцировке клеток. Синтетические проводники оказались клинически успешными только для восстановления очень коротких нервных разрывов менее 1–2 см. Кроме того, регенерация нервов с помощью этих каналов еще не достигла уровня функционального восстановления, наблюдаемого при использовании аутотрансплантатов нервов.

Коллаген-терполимер

Коллаген является основным компонентом внеклеточного матрикса и находится в поддерживающих тканях периферических нервов. Терполимер (TERP) был синтезирован путем свободнорадикальной сополимеризации трех его мономеров и сшит с коллагеном, создав гибридный биологически-синтетический гидрогелевый каркас. Терполимер основан на поли (НИПААМ), который, как известно, является безопасным для клеток полимером. TERP используется как сшивающий агент для повышения устойчивости гидрогеля, так и как место для прививки биоактивных пептидов или факторов роста путем взаимодействия некоторых из его акрилоксисукцинимидных групп с группами –NH2 на пептидах или факторах роста. Так как коллаген-терполимер (коллаген-ТЕРП) гидрогель не хватает биологически активный компонента, исследование прилагается к нему общая клеточной адгезии пептид найдено в ламинине (YIGSR) , с тем чтобы повысить его свойство клеточной адгезии.

Семейство сополимеров молочной и гликолевой кислот

Полимеры семейства PLGA включают поли (молочную кислоту) (PLA), поли (гликолевую кислоту) (PGA) и их сополимер сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA). Все три полимера были одобрены Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов для использования в различных устройствах. Эти полимеры хрупкие и не имеют областей для допустимой химической модификации; кроме того, они разлагаются по объему, а не по поверхности, что не является гладким и идеальным процессом разложения. В попытке преодолеть недостаток функциональности в их структуры были включены свободные амины, из которых можно связывать пептиды для контроля прикрепления и поведения клеток.

Метакрилированный декстран (Dex-MA), сополимеризованный с аминоэтилметакрилатом (AEMA)

Декстран - это полисахарид, полученный из бактерий; он обычно вырабатывается ферментами определенных штаммов лейконостока или стрептококка . Он состоит из α-1,6-связанных остатков D-глюкопиранозы. Гранулы перекрестно-сшитого декстранового гидрогеля широко используются в качестве матриц с низким связыванием белков для приложений колоночной хроматографии и для технологии культивирования клеток на микроносителях. Однако до недавнего времени гидрогели декстрана не исследовались в применении биоматериалов и, в частности, в качестве носителей для доставки лекарств. Преимущество использования декстрана в биоматериалах включает его устойчивость к адсорбции белка и клеточной адгезии, что позволяет определять специфическую клеточную адгезию с помощью преднамеренно прикрепленных пептидов из компонентов ECM. AEMA сополимеризовали с Dex-MA для того, чтобы ввести группы первичного амина, чтобы обеспечить сайт для присоединения пептидов, полученных из ECM, чтобы способствовать адгезии клеток. Пептиды могут быть иммобилизованы с использованием химии связывания сульфо-SMMC и пептидов с концевыми цистеиновыми группами. Сополимеризация Dex-MA с AEMA позволила сохранить макропористую геометрию каркасов в дополнение к стимулированию клеточных взаимодействий.

Поли (глицерин себацинат) (PGS)

Новый биоразлагаемый прочный эластомер был разработан из поли (глицерин себацината) (PGS) для использования в создании канала для направления нервов. PGS был первоначально разработан для инженерии мягких тканей, чтобы точно имитировать механические свойства ECM. Он считается эластомером, поскольку способен восстанавливаться после деформации в механически динамической среде и эффективно распределять напряжение, равномерно по регенерирующим тканям в виде микронапряжений. PGS синтезируется реакцией поликонденсации глицерина и себациновой кислоты, которая может быть обработана в расплаве или обработана растворителем для придания желаемой формы. PGS имеет модуль Юнга 0,28 МПа и предел прочности при растяжении более 0,5 МПа. Периферический нерв имеет модуль Юнга примерно 0,45 МПа, что очень близко к модулю ПГС. Кроме того, PGS подвергается деградации поверхности, что сопровождается потерей линейной массы и прочности во время рассасывания. После имплантации период полураспада был определен как 21 день; полное разложение произошло на 60 день. PGS испытывает минимальное водопоглощение во время разложения и не имеет заметного набухания; опухоль может вызвать деформацию, которая сужает просвет канальцев и может препятствовать регенерации. Преимущественно время разложения PGS можно варьировать, изменяя степень сшивания и соотношение себациновой кислоты к глицерину. В исследовании Sundback et al. (2005), имплантированные каналы PGS и PLGA давали сходные ранние тканевые реакции; однако воспалительные реакции PLGA усилились позже, в то время как воспалительные реакции PGS продолжали снижаться.

Гидрогель полиэтиленгликоля

Гидрогели полиэтиленгликоля (ПЭГ) биосовместимы и, как было доказано, переносятся многими типами тканей, включая ЦНС. Махони и Ансет сформировали гидрогели ПЭГ путем фотополимеризации метакрилатных групп, ковалентно связанных с разлагаемыми макромерами ПЭГ. Разложение гидрогеля отслеживали с течением времени путем измерения механической прочности (модуля сжатия) и среднего размера ячеек по данным коэффициента набухания. Первоначально полимерные цепи были сильно сшитыми, но по мере разложения сложноэфирные связи гидролизовались, что позволяло гелю набухать; модуль сжатия уменьшался по мере увеличения размера ячеек до полного растворения гидрогеля. Было продемонстрировано, что клетки-предшественники нейронов могут быть фотоинкапсулированы и культивированы на гелях PEG с минимальной гибелью клеток. Поскольку размер ячейки изначально небольшой, гидрогель блокирует воспалительные и другие подавляющие сигналы от окружающей ткани. По мере увеличения размера ячейки гидрогель может служить каркасом для регенерации аксонов.

Биологические полимеры

Использование биологических полимеров дает преимущества перед синтетическими полимерами. Очень вероятно, что они обладают хорошей биосовместимостью и легко разлагаются, потому что они уже присутствуют в природе в той или иной форме. Однако есть и несколько недостатков. Они обладают громоздкими механическими свойствами и скоростью разложения, которую невозможно контролировать в широком диапазоне. Кроме того, всегда существует вероятность того, что материалы природного происхождения могут вызывать иммунный ответ или содержать микробы. При производстве материалов природного происхождения также будут варьироваться от партии к партии крупномасштабные процедуры выделения, которые невозможно контролировать. Некоторые другие проблемы, с которыми сталкиваются природные полимеры, - это их неспособность поддерживать рост через длинные промежутки поражения из-за возможности коллапса, образования рубцов и ранней реабсорбции. Несмотря на все эти недостатки, некоторые из которых можно преодолеть, биологические полимеры по-прежнему являются оптимальным выбором во многих ситуациях.

Полисиаловая кислота (ПСА)

Полисиаловая кислота (ПСА) - относительно новый биосовместимый и биорезорбируемый материал для искусственных нервных проводников. Это гомополимер α2,8-связанных остатков сиаловой кислоты и динамически регулируемая посттрансляционная модификация молекулы адгезии нервных клеток (NCAM). Недавние исследования показали, что полисиалированный NCAM (polySia-NCAM) способствует регенерации двигательной системы. PSA показывает стабильность в условиях культивирования клеток и допускает индуцированную деградацию ферментами. Также недавно было обнаружено, что PSA участвует в управляющих процессах, таких как нейритогенез, поиск аксональных путей и миграция нейробластов. Животные с генетически нокаутированным ПСА проявляют летальный фенотип, путь к которому обнаружен неудачно; нервы, соединяющие два полушария головного мозга, были аномальными или отсутствовали. Таким образом, ПСА жизненно важен для правильного развития нервной системы.

Коллаген типа I / III

Коллаген является основным компонентом внеклеточного матрикса и широко используется для регенерации и восстановления нервов. Благодаря своей гладкой микрогеометрии и проницаемости коллагеновые гели способны обеспечивать диффузию молекул через них. Скорость резорбции коллагена можно контролировать путем сшивания коллагена полипоксисоединениями. Кроме того, каркасы коллагена I / III типа продемонстрировали хорошую биосовместимость и способны способствовать пролиферации шванновских клеток. Однако коллагеновые каналы, заполненные шванновскими клетками, используемые для перекрытия нервных промежутков у крыс, показали неожиданно неудачную регенерацию нервов по сравнению с нервными аутотрансплантатами. Это связано с тем, что биосовместимость - не единственный фактор, необходимый для успешной регенерации нервов; другие параметры, такие как внутренний диаметр, внутренний микрорельеф, пористость, толщина стенки и плотность засева шванновских клеток, необходимо будет изучить в будущих исследованиях, чтобы улучшить результаты, полученные с помощью этих гелей коллагена I / III.

Шелковое волокно паука

Показано, что волокна паучьего шелка способствуют клеточной адгезии, пролиферации и жизнеспособности. Allmeling, Jokuszies et al. показали, что клетки Шванна быстро и прочно прикрепляются к шелковым волокнам, разрастаясь в биполярную форму; показатели пролиферации и выживаемости шелковых волокон были нормальными.

Они использовали волокна паучьего шелка, чтобы создать нервный канал с шванновскими клетками и бесклеточными ксеногенными венами. Клетки Шванна образовали столбики вдоль шелковых волокон за короткий промежуток времени, и эти столбцы были похожи на полосы Бангнера, которые растут in vivo после повреждения ПНС. Пауковый шелк до сих пор не использовался в тканевой инженерии из-за хищной природы пауков и низкого выхода шелка от отдельных пауков. Было обнаружено, что вид Nephila clavipes производит шелк, который менее иммуногенен, чем шелк тутового шелкопряда; она имеет предел прочности на разрыв 4 x 109 Н / м, что в шесть раз превышает прочность стали на разрыв. Поскольку шелк паука подвергается протеолитической деградации, изменение pH по сравнению с физиологическим pH во время деградации не происходит. Другие преимущества паучьего шелка включают его устойчивость к грибковым и бактериальным разложениям в течение нескольких недель и тот факт, что он не набухает. Кроме того, структура шелка способствует адгезии и миграции клеток. Однако сбор шелка по-прежнему является утомительной задачей, и точный состав варьируется у разных видов и даже у особей одного и того же вида в зависимости от диеты и окружающей среды. Были попытки синтетического производства паучьего шелка. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы проверить возможность использования нервных проводников из паучьего шелка in vitro и in vivo .

Фиброин шелкопряда

Помимо пауков, шелкопряды - еще один источник шелка. Белок тутового шелкопряда Bombyx mori представляет собой ядро белка фиброина, окруженное серицином, который представляет собой семейство клееподобных белков. Фиброин охарактеризован как тяжелая цепь с повторяющейся гидрофобной и кристаллизующейся последовательностью: Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-X (X означает Ser или Tyr). Окружающий серицин более гидрофильный из-за многих полярных остатков, но он все же имеет некоторые гидрофобные части β-складок. Шелк издавна использовался в качестве швов из-за их высокой механической прочности и гибкости, а также проницаемости для воды и кислорода. Кроме того, с фиброином шелка можно легко манипулировать и стерилизовать. Однако использование шелка было прекращено, когда появились сообщения о нежелательных иммунологических реакциях. Недавно было обнаружено, что причина иммунологических проблем лежит исключительно в окружающем серицине. С момента этого открытия шелк с удаленным серицином использовался во многих фармацевтических и биомедицинских целях. Поскольку перед использованием шелка необходимо удалить серицин вокруг фиброина, необходимо разработать эффективную процедуру его удаления, известную как рафинирование. В одном методе рафинирования используется кипящий водный раствор Na 2 CO 3 , который удаляет серицин, не повреждая фиброин. Ян, Чен и др. продемонстрировали, что фиброин шелка и экстракт фиброина шелка обладают хорошей биосовместимостью с шванновскими клетками без цитотоксического воздействия на пролиферацию.

Хитозан

Хитозан и хитин принадлежат к семейству биополимеров, состоящих из β (1–4) -связанных субъединиц N-ацетил-D-глюкозамина и D-глюкозамина. Хитозан образуется в результате щелочного N-деацетилирования хитина, который является вторым по распространенности природным полимером после целлюлозы. Хитозан представляет собой биоразлагаемый полисахарид, который был полезен во многих биомедицинских приложениях, таких как хелатирующий агент, носитель лекарственного средства, мембрана и добавка для обработки воды. Хитозан растворим в разбавленных водных растворах, но осаждается в гель при нейтральном pH. Он плохо поддерживает прикрепление и пролиферацию нервных клеток, но может быть усилен присоединением пептида, производного от ECM. Хитозан также обладает слабыми механическими свойствами, преодолеть которые труднее.

Степень ацетилирования (DA) растворимого хитозана колеблется от 0% до 60%, в зависимости от условий обработки. Было проведено исследование, чтобы охарактеризовать, как изменение DA влияет на свойства хитозана. Различные DA получали с помощью уксусного ангидрида или щелочного гидролиза . Было обнаружено, что уменьшение ацетилирования приводит к увеличению прочности на сжатие. Биоразложение было исследовано с использованием лизоцима, который, как известно, в основном отвечает за разложение хитозана in vivo за счет гидролиза его гликозидных связей и высвобождается фагоцитарными клетками после повреждения нерва. Результаты показывают, что наблюдалась ускоренная потеря массы при использовании промежуточных DA по сравнению с высокими и низкими DA за исследуемый период времени. Когда клетки DRG выращивали на N-ацетилированном хитозане, жизнеспособность клеток снижалась с увеличением DA. Кроме того, хитозан имеет увеличивающуюся плотность заряда с уменьшением DA, что отвечает за большую адгезию клеток. Таким образом, контроль DA хитозана важен для регулирования времени разложения. Эти знания могут помочь в разработке нервного проводника из хитозана.

Арагонит

Недавно было показано, что арагонитовые каркасы поддерживают рост нейронов гиппокампа крысы. Shany et al. (2006) доказали, что арагонитовые матрицы могут поддерживать рост астроцитарных сетей in vitro и in vivo . Таким образом, каркасы из арагонита могут быть полезны для восстановления и регенерации нервной ткани. Предполагается, что происходящий из арагонита Ca 2+ необходим для обеспечения клеточной адгезии и межклеточного контакта. Вероятно, это осуществляется с помощью Ca 2+ -зависимых адгезионных молекул, таких как кадгерины. Кристаллические матрицы арагонита имеют много преимуществ перед гидрогелями. У них более крупные поры, что способствует лучшему росту клеток, а материал является биоактивным в результате высвобождения Ca 2+ , что способствует адгезии и выживанию клеток. Кроме того, арагонитовые матрицы обладают более высокой механической прочностью, чем гидрогели, что позволяет им выдерживать большее давление при вдавливании в поврежденную ткань.

Альгинат

Альгинат - это полисахарид, который легко образует цепочки; он может быть сшит по своим карбоксильным группам с многовалентными катионами, такими как Cu 2+ , Ca 2+ или Al 3+, с образованием более механически стабильного гидрогеля. Альгинаты кальция образуют биосовместимые и неиммуногенные полимеры, которые используются в тканевой инженерии. Однако они не могут поддерживать продольно ориентированный рост, который необходим для повторного соединения проксимального конца с его мишенью. Чтобы решить эту проблему, были разработаны анизотропные капиллярные гидрогели (ACH). Они создаются путем наложения водных растворов альгината натрия с водными растворами многовалентных катионов слоями. После образования ионы электролита диффундируют в слои раствора полимера, и диссипативный конвективный процесс заставляет ионы осаждаться, создавая капилляры. Диссипативный конвективный процесс приводит к противостоянию градиентов диффузии и трения между цепями полиэлектролита. Стенки капилляров выстланы осажденным альгинатом металла, а просвет заполнен экструдированной водой.

Prang et al. (2006) оценили способность гелей ACH стимулировать направленный рост аксонов в поврежденной ЦНС млекопитающих. Многовалентными ионами, используемыми для создания гелей ACH на основе альгината, были ионы меди, диффузия которых в слои альгината натрия создала гексагонально структурированные анизотропные капиллярные гели. После осаждения весь гель пересекали продольно ориентированные капилляры. Каркасы ACH способствовали выживанию взрослых NPC и высоко ориентированной регенерации аксонов. Это первый пример использования альгинатов для получения анизотропных структурированных капиллярных гелей. Необходимы дальнейшие исследования для изучения долгосрочной физической стабильности каркасов ACH, потому что регенерация аксонов ЦНС может занять много месяцев; однако, помимо способности обеспечивать долгосрочную поддержку, каркасы также должны быть разлагаемыми. Из всех биологических и синтетических биополимеров, исследованных Prang et al. (2006), только гели на основе агарозы могли сравниться с линейной регенерацией, вызванной каркасами ACH. В будущих исследованиях также необходимо будет выяснить, допускают ли каркасы ACH реиннервацию мишени in vivo после повреждения спинного мозга.

Гидрогель гиалуроновой кислоты

Гиалуроновая кислота (ГК) является широко используемым биоматериалом благодаря своей превосходной биосовместимости и разнообразию физиологических функций. Его много во внеклеточном матриксе (ЕСМ), где он связывает большие гликозаминогликаны (ГАГ) и протеогликаны посредством специфических взаимодействий с НА-белком. HA также связывает рецепторы клеточной поверхности, такие как CD44, что приводит к активации внутриклеточных сигнальных каскадов, которые регулируют клеточную адгезию и подвижность и способствуют пролиферации и дифференцировке. Также известно, что НА поддерживает ангиогенез, поскольку продукты его распада стимулируют пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток. Таким образом, HA играет ключевую роль в поддержании нормальных процессов, необходимых для выживания тканей. Немодифицированная ГК использовалась в клинических применениях, таких как глазная хирургия, заживление ран и пластическая хирургия. ГК можно сшивать с образованием гидрогелей. Гидрогели HA, которые были либо немодифицированы, либо модифицированы ламинином, были имплантированы в поражение центральной нервной системы взрослого и протестированы на их способность индуцировать образование нервной ткани в исследовании Hou et al. Они продемонстрировали способность поддерживать рост клеток и ангиогенез в в дополнение к ингибированию образования глиальных рубцов. Кроме того, гидрогели НА, модифицированные ламинином, были способны стимулировать расширение нейритов. Эти результаты подтверждают, что гели ГК являются многообещающим биоматериалом для нервных проводников.

Клеточная терапия

Помимо материала каркаса и физических сигналов, биологические сигналы также могут быть включены в биоискусственный нервный канал в виде клеток. В нервной системе существует множество различных типов клеток, которые помогают поддерживать рост и поддержание нейронов. Эти клетки вместе называются глиальными клетками. Глиальные клетки были исследованы в попытке понять механизмы, лежащие в основе их способности способствовать регенерации аксонов. Обсуждаются три типа глиальных клеток: шванновские клетки, астроциты и обонятельные клетки. Помимо глиальных клеток, стволовые клетки также потенциально полезны для восстановления и регенерации, поскольку многие из них способны дифференцироваться в нейроны или глиальные клетки. В этой статье кратко обсуждается использование взрослых трансдифференцированных мезенхимальных, эктомезенхимальных, нервных и нейральных стволовых клеток-предшественников.

Глиальные клетки

Глиальные клетки необходимы для поддержки роста и поддержания нейронов периферической и центральной нервной системы. Большинство глиальных клеток специфичны либо для периферической, либо для центральной нервной системы. Шванновские клетки расположены в периферической нервной системе, где они миелинизируют аксоны нейронов. Астроциты специфичны для центральной нервной системы; они обеспечивают нейроны питательными веществами, физической поддержкой и изоляцией. Они также образуют гематоэнцефалический барьер. Обонятельные обволакивающие клетки, однако, пересекают границу ЦНС-ПНС, потому что они направляют нейроны обонятельных рецепторов от ПНС к ЦНС.

Клетки Шванна

Шванновские клетки (SC) имеют решающее значение для регенерации периферических нервов; они играют как структурные, так и функциональные роли. Шванновские клетки ответственны за участие как в валлеровской дегенерации, так и в группах Бангнера. Когда периферический нерв поврежден, шванновские клетки изменяют свою морфологию, поведение и пролиферацию, чтобы стать участником валлеровской дегенерации и полос Бангнера. При валлеровской дегенерации клетки Шванна растут упорядоченными столбцами вдоль эндоневриальной трубки, создавая полосу Бангнера (boB), которая защищает и сохраняет эндоневриальный канал. Кроме того, они высвобождают нейротрофические факторы, которые усиливают отрастание в сочетании с макрофагами. У использования шванновских клеток в инженерии нервной ткани есть некоторые недостатки; например, трудно выборочно изолировать шванновские клетки, и они показывают плохую пролиферацию после выделения. Один из способов преодолеть эту трудность - искусственно индуцировать другие клетки, такие как стволовые, в SC-подобные фенотипы.

Eguchi et al. (2003) исследовали использование магнитных полей для выравнивания ячеек Шванна. Они использовали сверхпроводящий магнит горизонтального типа, который создает в его центре поле напряжением 8 Тл. В течение 60 часов после воздействия клетки Шванна выровнялись параллельно полю; в течение того же интервала не экспонированные шванновские клетки ориентировались случайным образом. Предполагается, что различия в восприимчивости к магнитному полю компонентов мембраны и элементов цитоскелета могут вызывать магнитную ориентацию. Волокна коллагена также подвергались воздействию магнитного поля, и в течение 2 часов они выстраивались перпендикулярно магнитному полю, в то время как волокна коллагена образовывали беспорядочную сетку без воздействия магнитного поля. При культивировании на коллагеновых волокнах шванновские клетки выстраиваются вдоль магнитно ориентированного коллагена после двух часов воздействия магнитного поля напряжением 8 Тл. Напротив, клетки Шванна беспорядочно ориентированы на коллагеновых волокнах без воздействия магнитного поля. Таким образом, культура на коллагеновых волокнах позволила шванновским клеткам ориентироваться перпендикулярно магнитному полю и ориентироваться намного быстрее.

Эти данные могут быть полезны для выравнивания шванновских клеток при повреждении нервной системы, чтобы способствовать образованию полос Бангнера, которые имеют решающее значение для поддержания эндоневральной трубки, которая направляет отрастающие аксоны обратно к своим мишеням. Практически невозможно выровнять шванновские клетки внешними физическими методами; таким образом, открытие альтернативной техники выравнивания имеет большое значение. Однако разработанный метод все еще имеет свои недостатки, а именно то, что требуется значительное количество энергии для поддержания магнитного поля в течение длительных периодов времени.

Были проведены исследования в попытках улучшить миграционную способность шванновских клеток. Миграция шванновских клеток регулируется интегринами с молекулами ЕСМ, такими как фибронектин и ламинин. Кроме того, известно, что молекула адгезии нервных клеток ( NCAM ) усиливает подвижность шванновских клеток in vitro . NCAM представляет собой гликопротеин, который экспрессируется на мембранах аксональных и шванновских клеток. Полисиаловая кислота (PSA) синтезируется на NCAM полисиалилтрансферазой (PST) и сиалилтрансферазой X (STX). Во время развития ЦНС экспрессия PSA в NCAM активируется до постнатальных стадий. Однако в мозге взрослого человека ПСА обнаруживается только в областях с высокой пластичностью . Экспрессия PSA не происходит на шванновских клетках.

Лавдас и др. (2006) исследовали, увеличивает ли устойчивая экспрессия PSA на шванновских клетках их миграцию. Шванновские клетки транслировали ретровирусным вектором, кодирующим STX, чтобы вызвать экспрессию PSA. Шванновские клетки, экспрессирующие ПСА, действительно приобрели повышенную подвижность, как продемонстрировано в тесте на восполнение пробелов и после трансплантации послеродовых культур срезов переднего мозга. Экспрессия ПСА не влияла на молекулярную и морфологическую дифференциацию. Экспрессирующие ПСА шванновские клетки были способны миелинизировать аксоны ЦНС в срезах мозжечка, что обычно невозможно in vivo . Есть надежда, что эти PSA-экспрессирующие шванновские клетки смогут мигрировать по ЦНС без потери миелинизирующих способностей и могут стать полезными для регенерации и миелинизации аксонов в центральной нервной системе.

Астроциты

Астроциты - это глиальные клетки, которых много в центральной нервной системе. Они имеют решающее значение для метаболической и трофической поддержки нейронов; кроме того, астроциты обеспечивают ионный буфер и клиренс нейротрансмиттеров. Растущие аксоны управляются сигналами, создаваемыми астроцитами; таким образом, астроциты могут регулировать поиск пути нейритов и, следовательно, формирование паттерна в развивающемся головном мозге. Глиальный рубец, образующийся после травмы в центральной нервной системе, образован астроцитами и фибробластами ; это самое серьезное препятствие для возрождения. Глиальный рубец состоит из гипертрофированных астроцитов, соединительной ткани и внеклеточного матрикса. Две цели инженерии нервной ткани - понять функцию астроцитов и разработать контроль над ростом астроцитов. Исследования Shany et al. (2006) продемонстрировали, что выживаемость астроцитов увеличивается на трехмерных арагонитовых матрицах по сравнению с традиционными двумерными культурами клеток. Способность клеточных процессов растягиваться по кривым и порам позволяет формировать несколько слоев клеток со сложной трехмерной конфигурацией.

Три различных способа, которыми клетки приобрели трехмерную форму:

  1. придерживаясь поверхности и следуя трехмерному контуру
  2. растягивание некоторых отростков между двумя кривизнами
  3. расширение процессов в трехмерном пространстве внутри слоев клеток при нахождении в многослойной ткани

В обычной клеточной культуре рост ограничен одной плоскостью, вызывая образование монослоя, при котором большинство клеток контактирует с поверхностью; однако трехмерная кривизна поверхности арагонита позволяет развиваться нескольким слоям, а астроциты, находящиеся далеко друг от друга, контактируют друг с другом. Важно способствовать формированию процесса, подобному 3D в условиях in vivo , потому что морфология астроцитарного процесса важна для определения направленности регенерирующих аксонов. Топография арагонита обеспечивает высокое отношение площади поверхности к объему и отсутствие краев, что приводит к уменьшению краевого эффекта культуры. Кристаллические матрицы, такие как упомянутый здесь арагонит, могут способствовать формированию сложной трехмерной ткани, которая приближается к условиям in vivo .

Обонятельные обволакивающие клетки

Первичная обонятельная система млекопитающих сохранила способность к непрерывной регенерации в зрелом возрасте. Обонятельные рецепторные нейроны имеют среднюю продолжительность жизни 6-8 недель и, следовательно, должны быть заменены клетками, дифференцированными от стволовых клеток, которые находятся в слое у основания ближайшего эпителия. Новые нейроны обонятельных рецепторов должны проецировать свои аксоны через ЦНС к обонятельной луковице , чтобы быть функциональными. Рост аксонов регулируется глиальным составом и цитоархитектурой обонятельной луковицы в дополнение к присутствию обонятельных обволакивающих клеток (OECs).

Предполагается, что OECs происходят из обонятельной плакоды , что указывает на иную эволюционную основу, чем у микроглии другой сходной нервной системы.

Другая интересная концепция заключается в том, что OECs обнаруживаются как в периферической, так и в центральной нервной частях первичной обонятельной системы, то есть в обонятельном эпителии и луковице.

OEC похожи на клетки Шванна в том, что они обеспечивают повышенную регуляцию низкоаффинного рецептора NGF p75 после повреждения; однако, в отличие от клеток Шванна, они производят более низкие уровни нейротрофинов . Несколько исследований показали, что OEC могут поддерживать регенерацию поврежденных аксонов, но эти результаты часто невозможно воспроизвести. Тем не менее, OEC были тщательно исследованы в отношении повреждений спинного мозга, бокового амиотрофического склероза и других нейродегенеративных заболеваний. Исследователи предполагают, что эти клетки обладают уникальной способностью ремиелинизировать поврежденные нейроны.

ОЭК обладают свойствами, аналогичными свойствам астроцитов , оба из которых были идентифицированы как восприимчивые к вирусной инфекции.

Стволовые клетки

Стволовые клетки характеризуются своей способностью к самообновлению в течение продолжительного времени и при этом сохраняют способность дифференцироваться по одному или нескольким клеточным линиям. Стволовые клетки могут быть унипотентными, мультипотентными или плюрипотентными, что означает, что они могут дифференцироваться в один, несколько или все типы клеток соответственно. Плюрипотентные стволовые клетки могут стать клетками, происходящими из любого из трех зародышевых листков эмбриона. Стволовые клетки имеют преимущество перед глиальными клетками, потому что они легче размножаются в культуре. Однако по-прежнему трудно упорядоченным образом дифференцировать эти клетки в различные типы клеток. Еще одна проблема со стволовыми клетками - это отсутствие четко определенного определения стволовых клеток, помимо гемопоэтических стволовых клеток (HSC). Каждый «тип» стволовых клеток имеет более одного метода идентификации, выделения и размножения клеток; это вызвало большую путаницу, потому что все стволовые клетки одного «типа» (нервные, мезенхимальные, ретинальные) не обязательно ведут себя одинаково в идентичных условиях.

Взрослые стволовые клетки

Взрослые стволовые клетки не способны пролиферировать и дифференцироваться in vitro так же эффективно, как in vivo . Взрослые стволовые клетки могут поступать из самых разных тканей, но их трудно изолировать, потому что они определяются поведением, а не поверхностными маркерами. Еще предстоит разработать метод четкого различения стволовых клеток и окружающих их дифференцированных клеток. Однако поверхностные маркеры все еще можно использовать до определенной степени для удаления большинства нежелательных дифференцированных клеток. Пластичность стволовых клеток - это способность дифференцироваться через границы зародышевой линии эмбриона. Тем не менее, наличие пластичности вызывает жаркие споры. Некоторые утверждают, что пластичность вызвана неоднородностью клеток или событиями слияния клеток. В настоящее время клетки можно дифференцировать по линиям клеток с выходом от 10% до 90% в зависимости от используемых методов. Необходимо провести дополнительные исследования, чтобы стандартизировать урожай с помощью трансдифференцировки. Трансдифференцировка мультипотентных стволовых клеток является потенциальным средством получения стволовых клеток, которые недоступны или нелегко получить у взрослых.

Мезенхимальные стволовые клетки

Мезенхимальные стволовые клетки - это взрослые стволовые клетки, расположенные в костном мозге; они способны дифференцироваться в клоны мезодермального происхождения. Некоторые примеры ткани, которую они образуют, - это кость , хрящ , жир и сухожилие . МСК получают путем аспирации костного мозга. Многие факторы способствуют росту МСК, включая фактор роста тромбоцитов , эпидермальный фактор роста β и инсулиноподобный фактор роста-1 . В дополнение к своим нормальным путям дифференцировки МСК могут трансдифференцироваться по немезенхимальным клонам, таким как астроциты, нейроны и миелинизирующие клетки ПНС. МСК потенциально полезны для стратегий регенерации нервов, потому что:

  1. их использование не является этической проблемой
  2. иммуносупрессия не требуется
  3. они являются обильным и доступным ресурсом
  4. они терпят генетические манипуляции

Keilhoff et al. (2006) выполнили исследование, сравнивающее способность недифференцированных и трансдифференцированных МСК к регенерации нервов с шванновскими клетками в омертвевших мышечных трансплантатах, перекрывающих 2-сантиметровую щель в седалищном нерве крысы. Все клетки были аутологичными. Трансдифференцированные МСК культивировали в смеси факторов, чтобы способствовать образованию клеток, подобных шванновским клеткам. Недифференцированные МСК не продемонстрировали регенеративной способности, в то время как трансдифференцированные МСК продемонстрировали некоторую регенеративную способность, хотя и не достигли способности шванновских клеток.

Эктомезенхимальные стволовые клетки

Сложность выделения шванновских клеток и последующего индуцирования пролиферации является большим препятствием. Решение состоит в том, чтобы избирательно индуцировать клетки, такие как эктомезенхимальные стволовые клетки (EMSC), в фенотип, подобный шванновским клеткам. EMSCs представляют собой клетки нервного гребня, которые мигрируют из краниального нервного гребня в первую жаберную дугу во время раннего развития периферической нервной системы. EMSC мультипотентны и обладают способностью к самообновлению. Их можно рассматривать как клетки-предшественники Шванна, потому что они связаны с ганглием дорсального корешка и развитием двигательных нервов. EMSC дифференциация по- видимому, регулируется внутренними генетическими программами и внеклеточных сигналов в окружающей среде. Шванновские клетки являются источником как нейротропных, так и нейротрофических факторов, необходимых для регенерации нервов, и основы для управления ростом. Не, Чжан и др. провели исследование, посвященное изучению преимуществ культивирования EMSC в каналах PLGA. Добавление фосколина и BPE к культуре EMSC вызывало образование удлиненных клеточных отростков, что является общим для шванновских клеток in vitro . Таким образом, фосколин и BPF могут вызывать дифференцировку фенотипов, подобных шванновским клеткам. BPE содержит цитокины GDNF , основной фактор роста фибробластов и фактор роста тромбоцитов , которые вызывают дифференцировку и пролиферацию глиальных и шванновских клеток путем активации киназ MAP . При имплантации в каналы PLGA, EMSC поддерживали долгосрочную выживаемость и способствовали регенерации периферических нервов через 10-миллиметровый промежуток, который обычно демонстрирует незначительную регенерацию или ее отсутствие. Миелинизированные аксоны присутствовали в трансплантатах, а базальные пластинки формировались внутри миелина. Эти наблюдения предполагают, что EMSC могут способствовать миелинизации регенерированных нервных волокон внутри кондуита.

Нервные клетки-предшественники

Вставка нейронов в биоискусственный нервный канал кажется наиболее очевидным методом замены поврежденных нервов; однако нейроны не могут размножаться, и они часто недолговечны в культуре. Таким образом, клетки-предшественники нейронов являются более многообещающими кандидатами на замену поврежденных и дегенерированных нейронов, поскольку они самообновляются, что позволяет производить in vitro множество клеток с минимальным количеством донорского материала. Для подтверждения того, что новые нейроны, образованные из клеток-предшественников нейронов, являются частью функциональной сети, необходимо наличие образования синапсов. Исследование Ma, Fitzgerald et al. является первой демонстрацией функционального синапса, производного от нервных стволовых клеток и клеток-предшественников, а также формирования нейрональной сети на трехмерной коллагеновой матрице. Клетки-предшественники нейронов разрослись и спонтанно дифференцировались в возбудимые нейроны и сформировали синапсы; более того, они сохранили способность дифференцироваться на три клона нервной ткани. Также было продемонстрировано, что не только происходит активная рециклинг синаптических пузырьков, но также формируются возбуждающие и тормозные связи, способные спонтанно генерировать потенциалы действия. Таким образом, клетки-предшественники нейронов являются жизнеспособным и относительно неограниченным источником для создания функциональных нейронов.

Нервные стволовые клетки

Нервные стволовые клетки (НСК) обладают способностью к самообновлению и дифференцировке на нейрональные и глиальные клоны. Многие методы культивирования были разработаны для управления дифференциацией NSC; однако создание биоматериалов для управления дифференцировкой НСК рассматривается как более клинически значимая и полезная технология. Один из подходов к разработке биоматериала для управления дифференцировкой NSC состоит в объединении компонентов внеклеточного матрикса (ECM) и факторов роста. В недавнем исследовании Накадзима, Ишимуро и др. изучили влияние различных молекулярных пар, состоящих из фактора роста и компонента ECM, на дифференцировку NSC в астроциты и нейрональные клетки. Исследованными компонентами ЕСМ были ламинин-1 и фибронектин, которые являются естественными компонентами ЕСМ, и проНектин F plus (Pro-F) и ProNectin L (Pro-L), которые являются искусственными компонентами ЕСМ, и поли (этиленимин) (PEI). В качестве нейротрофических факторов использовались эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фибробластов -2 (FGF-2), фактор роста нервов (NGF), нейротрофин-3 (NT-3) и цилиарный нейротрофический фактор (CNTF). Комбинации пар были иммобилизованы на матриксных клеточных массивах, на которых культивировали NSC. Через 2 дня культивирования клетки окрашивали антителами против нестина , β- тубулина III и GFAP , которые являются маркерами NSC, нейрональных клеток и астроцитов соответственно. Результаты предоставляют ценную информацию о выгодных комбинациях компонентов ECM и факторов роста в качестве практического метода разработки биоматериала для управления дифференцировкой NSC.

Нейротрофические факторы

В настоящее время нейротрофические факторы интенсивно изучаются для использования в биоискусственных нервных проводниках, поскольку они необходимы in vivo для управления ростом и регенерацией аксонов. В исследованиях нейротрофические факторы обычно используются в сочетании с другими методами, такими как биологические и физические сигналы, создаваемые добавлением клеток и определенных топографий. Нейротрофические факторы могут быть иммобилизованы или не иммобилизованы на каркасной структуре, хотя иммобилизация предпочтительна, поскольку она позволяет создавать постоянные контролируемые градиенты. В некоторых случаях, таких как нервные системы доставки лекарств , они слабо иммобилизованы, так что они могут избирательно высвобождаться в определенное время и в определенных количествах. Доставка лекарств - это следующий шаг после простого добавления факторов роста в нервные проводники.

Биомиметические материалы

Многие биоматериалы, используемые для направляющих нервов, являются биомиметическими . Биомиметические материалы представляют собой материалы, которые были разработаны таким образом, что они вызывают определенные клеточные ответы, опосредованные взаимодействиями с привязанными к каркасу пептидами из белков ЕСМ; по существу, включение связывающих клетки пептидов в биоматериалы посредством химической или физической модификации.

Синергизм

Синергизм часто возникает при сочетании двух элементов; это взаимодействие между двумя элементами, которое вызывает эффект больше, чем комбинированные эффекты каждого элемента в отдельности. Синергизм очевиден в сочетании материала каркаса и топографии с клеточной терапией, нейротрофическими факторами и биомиметическими материалами. Исследование синергизма - это следующий шаг после того, как отдельные методы доказали свою эффективность сами по себе. Комбинации этих различных факторов необходимо тщательно изучить, чтобы оптимизировать синергетические эффекты.

Оптимизация комбинаций нейротрофических факторов

Было высказано предположение, что взаимодействия между нейротрофическими факторами могут изменять оптимальные концентрации каждого фактора. Хотя выживаемость клеток и поддержание фенотипа важны, акцент при оценке был сделан на росте нейритов. Комбинация NGF , нейротрофического фактора, происходящего от линии глиальных клеток ( GDNF ), и цилиарного нейротрофического фактора ( CNTF ) была представлена культурам ганглиев дорсального корешка in vitro . Использовали один фактор из каждой нейротрофической семьи. Было определено, что нет разницы в индивидуальной оптимальной концентрации и комбинаторной оптимальной концентрации; однако примерно на 5 или 6 день нейриты перестали расти и начали деградировать. Было выдвинуто предположение, что это произошло из-за отсутствия критически важного питательного вещества или надлежащих градиентов; предыдущие исследования показали, что факторы роста способны оптимизировать расширение нейритов лучше всего, когда представлены в градиентах. Будущие исследования комбинаций нейротрофических факторов должны будут включать градиенты.

Комбинация молекул адгезии нервных клеток и GFD-5

Молекулы клеточной адгезии (CAM) и нейротрофические факторы, встроенные вместе в биосовместимые матрицы, - это относительно новая концепция, которая изучается. CAM суперсемейства иммуноглобулинов (IgSF), которое включает L1 / NgCAM и нейрофасцин, являются особенно многообещающими, поскольку они экспрессируются в развивающейся нервной системе на нейронах или шванновских клетках. Известно, что они служат ориентирами и опосредуют дифференцировку нейронов. Однако нейротрофические факторы, такие как NGF и фактор дифференцировки роста 5 (GDF-5), хорошо зарекомендовали себя в качестве промоторов регенерации in vivo . Недавнее исследование Niere, Brown et al. исследовали синергетические эффекты объединения L1 и нейрофасцина с NGF и GDF-5 на нейроны DRG в культуре; эта комбинация усиливала рост нейритов. Дальнейшее улучшение было продемонстрировано путем объединения L1 и нейрофасцина в искусственный гибридный белок, который повышает эффективность, поскольку факторы не доставляются индивидуально. Можно не только использовать разные реплики, но и объединить их в одну «новую» реплику.

Топография в синергии с химическими и биологическими подсказками

Эффект предъявления нескольких типов стимулов, таких как химические, физические и биологические сигналы, на дифференцировку нервных клеток-предшественников не изучался. Было проведено исследование, в котором три различных стимула были предъявлены клеткам-предшественникам гиппокампа взрослых крыс (AHPC): постнатальные астроциты крысы типа 1 (биологические), ламинин (химические) и субстрат с микропроцессором (физический). Более 75% AHPC выровнены в пределах 20 ° от канавок по сравнению со случайным ростом на подложках без рисунка. Когда AHPC выращивали на субстратах с микрорельефами с астроцитами, на рост влияли астроциты, которые выровнялись с бороздками; а именно, AHPCs расширяли отростки вдоль филаментов цитоскелета астроцитов. Однако выравнивание не было таким значительным, как у AHPC в культуре только с субстратом с микрорельефом. Чтобы оценить различные фенотипы, выраженные в результате дифференцировки, клетки окрашивали антителами к β-тубулину класса III (TuJI), рецептор-взаимодействующему белку (RIP) и глиальному фибриллярному кислому белку (GFAP), которые являются маркерами для ранние нейроны, олигодендроциты и астроциты соответственно. Наибольшая дифференциация наблюдалась при культивировании AHPC на структурированных субстратах с астроцитами.

использованная литература

внешние ссылки