Многоугольное рассеяние света - Multiangle light scattering

Многоугольное рассеяние света (MALS) описывает метод измерения света, рассеянного образцом, на множество углов. Он используется для определения как абсолютной молярной массы, так и среднего размера молекул в растворе путем определения того, как они рассеивают свет . Чаще всего используется коллимированный свет от лазерного источника, и в этом случае метод можно назвать многоугловым рассеянием лазерного света (МОЛЛС). Слово «лазер» было добавлено для того, чтобы убедить тех, кто раньше проводил измерения рассеяния света с помощью обычных источников света, таких как ртутные дуговые лампы, в том, что теперь можно проводить измерения под малым углом. До появления лазеров и связанных с ними тонких пучков узкой ширины ширина обычных световых пучков, используемых для таких измерений, препятствовала сбору данных при меньших углах рассеяния. В последние годы, поскольку все коммерческие приборы для светорассеяния используют лазерные источники, необходимость упоминания об источнике света отпала и повсюду используется термин MALS.

Термин «многоугловой» относится к обнаружению рассеянного света под разными дискретными углами, как измерено, например, одним детектором, перемещаемым в диапазоне, который включает в себя определенные выбранные углы, или массив детекторов, закрепленных в определенных угловых положениях. Представлено обсуждение физического явления, связанного с этим статическим рассеянием света , включая некоторые приложения, методы анализа данных и связанные с ним графические представления.

Фон

Измерение рассеянного света от освещенного образца составляет основу так называемого классического измерения светорассеяния . Исторически такие измерения проводились с помощью одного детектора, вращающегося по дуге вокруг освещенного образца. Первым коммерческим прибором (формально называемым «рассеянным фотометром») был светорассеивающий фотометр Brice-Phoenix, представленный в середине 1950-х годов, а за ним последовал фотометр Sofica, представленный в конце 1960-х годов.

Измерения обычно выражали как интенсивность рассеяния или рассеянную освещенность. Поскольку сбор данных производился, когда детектор располагался в разных местах дуги, каждое положение соответствовало разному углу рассеяния, концепция размещения отдельного детектора в каждом угловом местоположении, представляющем интерес, была хорошо понята, хотя и не реализовывалась на коммерческой основе до тех пор, пока конец 1970-х гг. Несколько детекторов, имеющих разную квантовую эффективность, имеют разный отклик и, следовательно, должны быть нормализованы в этой схеме. Интересная система, основанная на использовании высокочувствительной пленки, была разработана Брюнстингом и Маллани в 1974 году. Она позволила записать на пленку весь диапазон интенсивностей рассеяния с последующим сканированием денситометром, обеспечивающим относительные интенсивности рассеяния. Тогда обычное использование одного детектора вращается вокруг освещенного образца с интенсивностью , собранных на называли определенными углами дифференциальное рассеяние света после квантово - механическое понятие дифференциального сечения , a (Q) , выраженные в милли-барн / стерадиан. Измерения дифференциального сечения обычно проводились, например, для изучения структуры атомного ядра путем рассеяния на них нуклонов, таких как нейтроны . Важно различать дифференциальное рассеяние света и динамическое рассеяние света , оба из которых обозначаются инициалами DLS. Последнее относится к совершенно иной методике измерения флуктуации рассеянного света из-за конструктивной и деструктивной интерференции, причем частота связана с тепловым движением, броуновским движением молекул или частиц в растворе или суспензии.

Для измерения MALS требуется набор вспомогательных элементов. Наиболее важным из них является коллимированный или сфокусированный световой пучок (обычно от лазерного источника, создающий коллимированный пучок монохроматического света), который освещает область образца. В современных приборах луч обычно плоско поляризован перпендикулярно плоскости измерения, хотя могут использоваться и другие поляризации, особенно при изучении анизотропных частиц. Ранее измерения, до появления лазеров, проводились с использованием сфокусированных, хотя и неполяризованных, световых лучей от таких источников, как ртутные дуговые лампы. Другой необходимый элемент - это оптическая ячейка для хранения измеряемого образца. В качестве альтернативы можно использовать ячейки, содержащие средства для измерения текущих проб. Если необходимо измерить рассеивающие свойства отдельных частиц, необходимо обеспечить средства для введения таких частиц по одной через световой луч в точку, обычно равноудаленную от окружающих детекторов.

Хотя большинство измерений на основе MALS выполняется в плоскости, содержащей набор детекторов, обычно расположенных на одинаковом расстоянии от центрально расположенного образца, через который проходит освещающий луч, также были разработаны трехмерные версии, в которых детекторы лежат на поверхности сферы с контролируемый образец проходит через его центр, где он пересекает путь падающего светового луча, проходящего по диаметру сферы. Первая схема используется для измерения аэрозольных частиц, а вторая - для исследования морских организмов, таких как фитопланктон .

Традиционное измерение дифференциального рассеяния света было практически идентично используемому в настоящее время методу MALS. Хотя метод MALS обычно собирает мультиплексированные данные последовательно с выходов набора дискретных детекторов, более раннее измерение дифференциального рассеяния света также собирало данные последовательно, когда один детектор перемещался от одного угла сбора к другому. Реализация MALS, конечно, намного быстрее, но одни и те же типы данных собираются и интерпретируются одинаково. Таким образом, два термина относятся к одному и тому же понятию. Для измерений дифференциального рассеяния света фотометр рассеяния света имеет единственный детектор, тогда как фотометр рассеяния света MALS обычно имеет множество детекторов.

Другой тип устройства MALS был разработан в 1974 г. Salzmann et al. на основе детектора светового рисунка, изобретенного Джорджем и др. для Litton Systems Inc. в 1971 году. Детектор Litton был разработан для измерения распределения световой энергии в задней фокальной плоскости сферической линзы для определения геометрических соотношений и распределения спектральной плотности объектов, записанных на пленках.

Применение детектора Литтона Зальцманом и др. обеспечивает измерение при 32 малых углах рассеяния от 0 ° до 30 ° и усреднение по широкому диапазону азимутальных углов, поскольку наиболее важными углами являются прямые углы для статического рассеяния света. К 1980 году Бартоли и др. разработал новый подход к измерению рассеяния при дискретных углах рассеяния с использованием эллиптического отражателя, позволяющего проводить измерения при 30 полярных углах в диапазоне 2,5 ° ≤ θ ≤ 177,5 ° с разрешением 2,1 °.

Коммерциализация многоугловых систем началась в 1977 году , когда Science Spectrum, Inc. запатентовала проточную капиллярную систему для индивидуальной системы биопроб , разработанной для USFDA . Первый коммерческий прибор MALS, включающий 8 дискретных детекторов, был доставлен компании SC Johnson and Son компанией Wyatt Technology в 1983 году, после чего в 1984 году был продан первый прибор с 15 детекторами потока (Dawn-F) компании AMOCO. К 1988 году трехмерная конфигурация была введена специально для измерения рассеивающих свойств отдельных аэрозольных частиц. Примерно в то же время был построен подводный прибор для измерения свойств рассеянного света отдельного фитопланктона. Сигналы собирались оптическими волокнами и передавались на индивидуальные фотоумножители. Примерно в декабре 2001 года был коммерциализирован прибор, который измеряет 7 углов рассеяния с помощью ПЗС- детектора (BI-MwA: Brookhaven Instruments Corp, Хотлсвилл, Нью-Йорк).

Литература, связанная с измерениями, выполненными с помощью фотометров MALS, обширна. как в отношении периодических измерений частиц / молекул, так и измерений после фракционирования с помощью хроматографических средств, таких как эксклюзионная хроматография (SEC), обращенно-фазовая хроматография (RPC) и фракционирование в полевом потоке (FFF).

Теория

Интерпретация измерений рассеяния, выполненных в многоугольных точках, основана на некотором знании априорных свойств измеряемых частиц или молекул. Лучше всего интерпретировать характеристики рассеяния различных классов таких рассеивателей, применяя соответствующую теорию. Например, чаще всего применяются следующие теории.

Рэлеевское рассеяние является самым простым и описывает упругое рассеяние света или другого электромагнитного излучения на объектах, размер которых намного меньше длины падающей волны. Этот тип рассеяния отвечает за голубой цвет неба в течение дня и обратно пропорционален четвертой степени длины волны.

Приближение Рэлея-Ганса является средством интерпретации MALS измерений с предположением , что рассеивающие частицы имеют показатель преломления, п ₁ , очень близко к показателю преломления окружающей среды, п ₀ . Если мы положим m = n ₁ / n ₀ и предположим, что | m - 1 | << 1 , то такие частицы можно рассматривать как состоящие из очень малых элементов, каждый из которых может быть представлен как рэлеевская частица. Таким образом, предполагается, что каждый маленький элемент более крупной частицы рассеивается независимо от других.

Теория Лоренца – Ми используется для интерпретации рассеяния света однородными сферическими частицами. Приближение Рэлея – Ганса и теория Лоренца – Ми дают идентичные результаты для однородных сфер в пределе | 1 - m | → 0 .

Теория Лоренца-Ми может быть обобщена на сферически-симметричные частицы на основании ссылки. Erma рассмотрела более общие формы и структуры.

Данные по рассеянию обычно представляются в виде так называемого избыточного отношения Рэлея, определяемого как отношение Рэлея раствора или события одиночной частицы, из которого вычитается отношение Рэлея самой несущей жидкости и других фоновых вкладов, если таковые имеются. Коэффициент Рэлея, измеренный на детекторе, лежащем под углом θ и проходящем под телесным углом ΔΩ , определяется как интенсивность света на единицу телесного угла на единицу падающей интенсивности, I ₀ , на единицу освещенного рассеивающего объема ΔV . Объем рассеяния ΔV, из которого рассеянный свет достигает детектора, определяется полем обзора детектора, обычно ограниченным апертурами, линзами и ограничителями. Рассмотрим теперь измерение MALS, выполненное в плоскости из суспензии N идентичных частиц / молекул на мл, освещенной тонким лучом света, создаваемым лазером. Предполагая, что свет поляризован перпендикулярно плоскости детекторов. Интенсивность рассеянного света, измеренная детектором под углом θ, превышающая интенсивность рассеянного взвешенной жидкостью, будет равна

${\ Displaystyle I (\ theta) = {\ frac {I_ {0} N \ Delta V} {(kr) ^ {2}}} я (\ theta)}$,

где i (θ) - функция рассеяния отдельной частицы, k = 2πn ₀ / λ ₀ , n ₀ - показатель преломления суспендирующей жидкости, а λ ₀ - длина волны падающего света в вакууме. Избыточное отношение Рэлея R (θ) тогда определяется выражением

${\ Displaystyle R (\ theta) = {\ frac {I (\ theta) r ^ {2}} {I_ {0} \ Delta V}} = Ni (\ theta) / k ^ {2}}$.

Даже для простой однородной сферы радиуса a, показатель преломления n которой почти такой же, как показатель преломления n ₀ суспендированной жидкости, то есть приближение Рэлея – Ганса, функция рассеяния в плоскости рассеяния является относительно сложной количество

${\ displaystyle i (\ theta) = {\ frac {k ^ {2} V ^ {2} \ left | {m-1} \ right | ^ {2}} {4 \ pi ^ {2}}} G ^ {2} \ left ({2ka \ sin {\ frac {\ theta} {2}}} \ right)}$, куда

${\ Displaystyle G (\ xi) = {\ гидроразрыва {3} {\ xi ^ {2}}} (\ sin \ xi - \ xi \ cos \ xi)}$,    ,    ${\ displaystyle k = {\ frac {2 \ pi n_ {0}} {\ lambda _ {0}}}}$${\ displaystyle V = {\ frac {4} {3}} \ pi a ^ {3}}$

и λ ₀ является длиной волны падающего света в вакууме.

Приложения

Заговор Zimm и пакетный сбор

MALS чаще всего используется для определения массы и размера молекул в растворе. Ранние реализации MALS, такие как те, которые обсуждались Бруно Х. Зиммом в его статье «Аппарат и методы измерения и интерпретации углового изменения рассеяния света; Предварительные результаты по растворам полистирола »включали использование одного детектора, вращающегося вокруг образца, содержащегося в прозрачном сосуде. Такие измерения MALS для нетекучих образцов обычно называют «измерениями партии». Создавая образцы в нескольких известных низких концентрациях и обнаружение рассеянного света относительно образца под разными углами, можно создать сюжет ZIMM откладывая: против где с концентрацией образца и к является коэффициент растяжения клал кс и в тот же числовой диапазон. ${\ displaystyle {\ frac {K ^ {*} c} {R _ {\ theta}}}}$${\ displaystyle \ sin ^ {2} {\ frac {\ theta} {2}} + kc}$${\ displaystyle \ sin ^ {2} {\ frac {\ theta} {2}}}$

При построении графика можно экстраполировать как на нулевой угол, так и на нулевую концентрацию, и анализ графика даст среднеквадратичный радиус молекул образца от начального наклона линии c = 0 и молярную массу молекулы в точке, где оба концентрация и угол равны нулю. Усовершенствования графика Зимма, которые включают все собранные данные, обычно называемые «глобальным соответствием», в значительной степени заменили график Зимма в современном пакетном анализе.

SEC и режим потока

С появлением эксклюзионной хроматографии (SEC) измерения MALS начали использоваться в сочетании с детектором концентрации в режиме онлайн для определения абсолютной молярной массы и размера фракций образца, элюируемых из колонки, а не в зависимости от методов калибровки. Эти измерения MALS в режиме потока были распространены на другие методы разделения, такие как фракционирование в полевом потоке , ионообменная хроматография и обращенно-фазовая хроматография .

Угловая зависимость данных светорассеяния показана ниже на рисунке смеси полистирольных сфер, разделенных SEC. Два самых маленьких образца (крайний правый) элюировались последними и не имели угловой зависимости. Второй справа образец показывает линейное угловое изменение с увеличением интенсивности при меньших углах рассеяния. Самый большой образец слева элюируется первым и показывает нелинейное угловое изменение.

Полезность измерений MALS

Молярная масса и размер

Связывание MALS с встроенным детектором концентрации после средства разделения образца, такого как SEC, позволяет вычислить молярную массу элюируемого образца в дополнение к его среднеквадратичному радиусу. На рисунке ниже представлено хроматографическое разделение агрегатов BSA. Показаны сигнал рассеяния света под углом 90 ° от детектора MALS и значения молярной массы для каждого элюированного среза.

Молекулярные взаимодействия

Поскольку MALS может определять молярную массу и размер молекул, он позволяет изучать связывание белок-белок, олигомеризацию и кинетику самосборки, ассоциации и диссоциации. Сравнивая молярную массу образца с его концентрацией, можно определить сродство связывания и стехиометрию взаимодействующих молекул.

Ветвление и молекулярная конформация

Коэффициент разветвления полимера относится к количеству разветвленных звеньев в случайно разветвленном полимере и количеству ветвей в полимерах с разветвленной звездой и был определен Зиммом и Штокмайером как

${\ displaystyle g = {\ frac {R_ {b} ^ {2}} {R_ {l} ^ {2}}}}$

Где - средний квадратный радиус разветвленных и линейных макромолекул с одинаковыми молярными массами. Используя MALS в сочетании с детектором концентрации, как описано выше, можно создать логарифмический график зависимости среднеквадратичного радиуса от молярной массы. Наклон этого графика дает коэффициент ветвления g. ${\ displaystyle R ^ {2}}$

Помимо разветвления, логарифмический график зависимости размера от молярной массы указывает на форму или конформацию макромолекулы. Увеличение наклона графика указывает на изменение конформации полимера от сферической, случайной спирали до линейной. Комбинирование среднеквадратичного радиуса из MALS с гидродинамическим радиусом, полученным из измерений DLS, дает коэффициент формы ρ = для каждой фракции размера макромолекул. ${\ displaystyle r_ {h}}$${\ displaystyle {\ frac {r_ {g}} {r_ {h}}}}$

Другие приложения

Другие приложения MALS включают определение размера наночастиц , исследования агрегации белков , белок-белковые взаимодействия , электрофоретическую подвижность или дзета-потенциал. Методы MALS были приняты для изучения стабильности фармацевтических препаратов и их использования в наномедицине .

использованная литература