Внутриклеточный pH - Intracellular pH
Внутриклеточный pH ( pHi ) - это мера кислотности или основности (т.е. pH ) внутриклеточной жидкости . PHi играет решающую роль в мембранном транспорте и других внутриклеточных процессах. В среде с неподходящим pHi биологические клетки могут нарушать функцию. Следовательно, pHi строго регулируется, чтобы обеспечить правильную клеточную функцию, контролируемый рост клеток и нормальные клеточные процессы. Механизмы, регулирующие pHi, обычно считаются переносчиками плазматической мембраны, из которых существуют два основных типа - те, которые зависят, и те, которые не зависят от концентрации бикарбоната ( HCO-
3). Физиологически нормальный внутриклеточный pH чаще всего находится между 7,0 и 7,4, хотя между тканями существует различие (например, pH скелетных мышц млекопитающих обычно составляет 6,8–7,1). В разных органеллах также наблюдается колебание pH , которое может составлять примерно от 4,5 до 8,0. pHi можно измерить несколькими способами.
Гомеостаз
Внутриклеточный pH обычно ниже, чем внеклеточный pH из-за более низких концентраций HCO 3 - . Повышение внеклеточного (например, сыворотка ) парциальное давление из углекислого газа ( рСО 2 ) выше 45 мм рт.ст. приводит к образованию угольной кислоты , что вызывает снижение PHI , как это диссоциирует :
- H 2 O + CO 2 ⇌ H 2 CO 3 ⇌ H + + HCO 3 -
Поскольку биологические клетки содержат жидкость, которая может действовать как буфер, pHi можно довольно хорошо поддерживать в определенном диапазоне. Клетки корректировать свои PHI , соответственно , при увеличении кислотности или основности, как правило , с помощью CO 2 или HCO 3 - датчики представить в мембране клетки. Эти сенсоры могут позволить H + проходить через клеточную мембрану, соответственно, позволяя pHi быть взаимосвязанным с внеклеточным pH в этом отношении.
Основные внутриклеточные буферные системы включают те, которые включают белки или фосфаты. Поскольку белки имеют кислые и основные области, они могут служить как донорами, так и акцепторами протонов для поддержания относительно стабильного внутриклеточного pH. В случае фосфатного буфера значительные количества слабой кислоты и конъюгированного слабого основания (H 2 PO 4 - и HPO 4 2– ) могут соответственно принимать или отдавать протоны для сохранения внутриклеточного pH:
- OH - + H 2 PO 4 - ⇌ H 2 O + HPO 4 2–
- H + + HPO 4 2– ⇌ H 2 PO 4 -
В органеллах
Уровень pH в конкретной органелле зависит от ее конкретной функции.
Например, лизосомы имеют относительно низкий pH 4,5. Кроме того, методы флуоресцентной микроскопии показали, что фагоциты также имеют относительно низкий внутренний pH. Поскольку обе эти органеллы являются деградирующими органеллами, которые поглощают и расщепляют другие вещества, им требуется высокая внутренняя кислотность для успешного выполнения своей предполагаемой функции.
В отличие от относительно низкого pH внутри лизосом и фагоцитов, митохондриальный матрикс имеет внутренний pH около 8,0, что примерно на 0,9 единицы pH выше, чем внутри межмембранного пространства. Поскольку окислительное фосфорилирование должно происходить внутри митохондрий, это несоответствие pH необходимо для создания градиента через мембрану. Именно этот мембранный потенциал позволяет митохондриям вырабатывать большое количество АТФ.
Измерение
Существует несколько распространенных способов измерения внутриклеточного pH (pHi), в том числе с помощью микроэлектрода, красителя, чувствительного к pH, или с помощью методов ядерного магнитного резонанса. Для измерения pH внутри органелл можно использовать метод, использующий pH-чувствительные зеленые флуоресцентные белки (GFP).
В целом, у всех трех методов есть свои преимущества и недостатки. Использование красителей, возможно, является самым простым и достаточно точным, в то время как ЯМР представляет собой проблему относительно меньшей точности. Кроме того, использование микроэлектрода может быть проблематичным в ситуациях, когда клетки слишком малы или целостность клеточной мембраны не должна нарушаться. GFP уникальны тем, что они обеспечивают неинвазивный способ определения pH внутри различных органелл, но этот метод не является наиболее точным в количественном отношении способом определения pH.
Микроэлектрод
Микроэлектродный метод измерения pHi заключается в помещении очень маленького электрода в цитозоль клетки, проделывая очень маленькое отверстие в плазматической мембране клетки. Поскольку внутри микроэлектрода находится жидкость с высокой концентрацией H + по сравнению с внешней стороной электрода, возникает потенциал из-за несоответствия pH внутри и снаружи электрода. По этой разнице напряжений и заранее определенному pH жидкости внутри электрода можно определить внутриклеточный pH (pHi) интересующей клетки.
Флуоресцентная спектроскопия
Другой способ измерения внутриклеточного pH (pHi) - использовать красители, чувствительные к pH и флуоресцирующие по-разному при различных значениях pH. Этот метод, использующий флуоресцентную спектроскопию, заключается в добавлении этого специального красителя в цитозоль клетки. Возбуждая краситель в клетке энергией света и измеряя длину волны света, испускаемого фотоном, когда он возвращается в свое естественное энергетическое состояние, можно определить тип присутствующего красителя и связать его с внутриклеточным pH данного клетка.
Ядерный магнитный резонанс
В дополнение к использованию pH-чувствительных электродов и красителей для измерения pHi, спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) также может использоваться для количественного определения pHi. ЯМР, как правило, выявляет информацию о внутренней части клетки, помещая клетку в среду с сильным магнитным полем. На основании соотношения между концентрациями протонированных и депротонированных форм фосфатных соединений в данной клетке можно определить внутренний pH клетки. Кроме того, ЯМР также можно использовать для выявления присутствия внутриклеточного натрия, который также может предоставить информацию о pHi.
С помощью ЯМР-спектроскопии было определено, что лимфоциты поддерживают постоянный внутренний pH 7,17 ± 0,06, хотя, как и все клетки, внутриклеточный pH изменяется в том же направлении, что и внеклеточный pH.
pH-чувствительные GFP
Чтобы определить pH внутри органелл, pH-чувствительные GFP часто используются как часть неинвазивного и эффективного метода. Используя кДНК в качестве матрицы вместе с соответствующими праймерами, ген GFP может быть экспрессирован в цитозоле, а продуцируемые белки могут нацеливаться на определенные области внутри клетки, такие как митохондрии, аппарат Гольджи, цитоплазма и эндоплазматический ретикулум. Если в этих экспериментах используются определенные мутанты GFP, которые очень чувствительны к pH во внутриклеточной среде, относительное количество результирующей флуоресценции может показать приблизительный pH окружающей среды.