Скрининг с высокой пропускной способностью - High-throughput screening

Роботы-досмотрщики с высокой пропускной способностью

Высокопроизводительный скрининг ( HTS ) - это метод научных экспериментов, который особенно используется при открытии лекарств и имеет отношение к областям биологии и химии . Используя робототехнику , программное обеспечение для обработки / управления данными, устройства для обработки жидкостей и чувствительные детекторы, высокопроизводительный скрининг позволяет исследователю быстро проводить миллионы химических, генетических или фармакологических тестов. С помощью этого процесса можно быстро идентифицировать активные соединения, антитела или гены, которые модулируют конкретный биомолекулярный путь. Результаты этих экспериментов служат отправной точкой для разработки лекарств и для понимания невзаимодействия или роли конкретного места.

Подготовка аналитического планшета

Рука робота работает с планшетом для анализа

Основным лабораторным оборудованием или сосудом для тестирования HTS является микротитровальный планшет : небольшой контейнер, обычно одноразовый и сделанный из пластика, который имеет решетку из небольших открытых углублений, называемых лунками . Обычно микропланшеты для HTS имеют 96, 192, 384, 1536, 3456 или 6144 лунки. Все они кратны 96, что отражает исходный 96-луночный микропланшет с разнесенными лунками 8 x 12 с интервалом 9 мм. Большинство лунок содержат тестовые объекты, в зависимости от характера эксперимента. Это могут быть различные химические соединения , растворенные , например , в водном растворе в диметилсульфоксиде (ДМСО). Лунки также могут содержать клетки или ферменты определенного типа. (Другие лунки могут быть пустыми или содержать образцы чистого растворителя или необработанные, предназначенные для использования в качестве экспериментальных контролей .)

В центре скрининга обычно хранится библиотека стандартных планшетов , содержимое которых тщательно каталогизируется, и каждая из которых может быть создана лабораторией или получена из коммерческого источника. Сами по себе эти стандартные тарелки непосредственно в экспериментах не используются; вместо этого по мере необходимости создаются отдельные аналитические планшеты . Планшет для анализа - это просто копия исходного планшета, созданная пипеткой небольшого количества жидкости (часто измеряемого в нанолитрах ) из лунок исходного планшета в соответствующие лунки полностью пустого планшета.

Наблюдение за реакцией

Чтобы подготовиться к анализу , исследователь заполняет каждую лунку планшета каким-либо биологическим объектом, на котором он хочет провести эксперимент, например, белком , клетками или эмбрионом животного . По прошествии некоторого времени инкубации, позволяющего биологическому веществу абсорбироваться, связываться или иным образом реагировать (или не реагировать) с соединениями в лунках, измерения проводятся во всех лунках планшета вручную или с помощью машины. Ручные измерения часто необходимы, когда исследователь использует микроскопию, чтобы (например) искать изменения или дефекты эмбрионального развития, вызванные соединениями лунок, ища эффекты, которые компьютер не может легко определить самостоятельно. В противном случае специализированная автоматическая аналитическая машина может провести ряд экспериментов с лунками (например, направить на них поляризованный свет и измерить отражательную способность, которая может указывать на связывание с белками). В этом случае машина выводит результат каждого эксперимента в виде сетки числовых значений, при этом каждое число соответствует значению, полученному из одной скважины. Высокопроизводительная аналитическая машина может измерять десятки пластин за несколько минут, как эта, очень быстро генерируя тысячи экспериментальных точек данных.

В зависимости от результатов этого первого анализа исследователь может выполнять последующие анализы в рамках одного и того же скрининга, «отбирая» жидкость из исходных лунок, которая дала интересные результаты (известные как «совпадения»), в новые аналитические планшеты, а затем повторно запускает эксперимент по сбору дополнительных данных об этом суженном наборе, подтверждающих и уточняющих наблюдения.

Системы автоматизации

Карусельная система для хранения аналитических планшетов для большой емкости и высокоскоростного доступа

Автоматизация - важный элемент полезности HTS. Обычно интегрированная роботизированная система, состоящая из одного или нескольких роботов, транспортирует аналитические микропланшеты от станции к станции для добавления образцов и реагентов, смешивания, инкубации и, наконец, считывания или обнаружения. Система HTS обычно может готовить, инкубировать и анализировать множество планшетов одновременно, что еще больше ускоряет процесс сбора данных. В настоящее время существуют роботы HTS, которые могут тестировать до 100 000 соединений в день. Автоматические сборщики колоний отбирают тысячи микробных колоний для высокопроизводительного генетического скрининга. Термин uHTS или сверхвысокопроизводительный скрининг (около 2008 г.) относится к скринингу более 100 000 соединений в день.

Экспериментальный план и анализ данных

Благодаря возможности быстрого скрининга различных соединений (таких как небольшие молекулы или миРНК ) для идентификации активных соединений, HTS привел к резкому увеличению объемов данных, генерируемых в последние годы. Следовательно, одна из самых фундаментальных проблем в экспериментах с HTS - это получение биохимической значимости из множества данных, которые основаны на разработке и принятии соответствующих экспериментальных планов и аналитических методов как для контроля качества, так и для отбора попаданий. Исследования HTS - одна из областей, в которых есть особенность, описанная Джоном Блюмом, главным научным сотрудником Applied Proteomics, Inc., следующим образом: Вскоре, если ученый не понимает некоторых статистических данных или элементарных технологий обработки данных, он или она может не считаться настоящим молекулярным биологом и, таким образом, просто станет «динозавром».

Контроль качества

Высококачественные анализы HTS имеют решающее значение в экспериментах с HTS. Разработка высококачественных тестов HTS требует интеграции экспериментальных и вычислительных подходов к контролю качества (QC). Три важных средства контроля качества: (i) хороший дизайн планшета, (ii) выбор эффективных положительных и отрицательных химических / биологических контролей и (iii) разработка эффективных показателей контроля качества для измерения степени дифференциации, чтобы проводить анализы с низкими данными. качество можно определить. Хорошая конструкция планшета помогает выявить систематические ошибки (особенно те, которые связаны с положением лунки) и определить, какую нормализацию следует использовать для устранения / уменьшения влияния систематических ошибок как на контроль качества, так и на выбор совпадений.

Эффективные аналитические методы контроля качества служат своего рода привратником для проведения анализов отличного качества. В типичном эксперименте HTS четкое различие между положительным контролем и отрицательным эталоном, таким как отрицательный контроль, является показателем хорошего качества. Было предложено множество мер оценки качества для измерения степени различия между положительным контролем и отрицательным эталоном. Отношение сигнал / фон, отношение сигнал / шум, окно сигнала, коэффициент вариабельности анализа и Z-фактор были приняты для оценки качества данных. Строго стандартизированная разница средних ( SSMD ) недавно была предложена для оценки качества данных в анализах HTS.

Выбор хита

Соединение с желаемым размером эффектов в HTS называется хитом. Процесс выбора совпадений называется выбором совпадений. Аналитические методы выбора совпадений на экранах без реплик (обычно на первичных экранах) отличаются от методов с репликами (обычно на подтверждающих экранах). Например, метод z-оценки подходит для экранов без реплик, тогда как t-статистика подходит для экранов с репликами. Расчет SSMD для экранов без реплик также отличается от расчета для экранов с репликами.

Для выбора совпадений на первичных экранах без повторов легко интерпретируемыми являются среднее кратное изменение, средняя разница, процент ингибирования и процент активности. Однако они не позволяют эффективно улавливать изменчивость данных. Метод z-оценки или SSMD, который может фиксировать изменчивость данных на основе предположения, что каждое соединение имеет такую ​​же изменчивость, что и отрицательная ссылка на экранах. Однако выбросы являются обычным явлением в экспериментах HTS, а такие методы, как z-оценка, чувствительны к выбросам и могут быть проблематичными. Как следствие, для выбора совпадений были предложены и приняты надежные методы, такие как метод z * -счета, SSMD *, метод B-оценки и метод на основе квантилей.

На экране с повторениями мы можем напрямую оценить вариабельность для каждого соединения; как следствие, мы должны использовать SSMD или t-статистику, которая не полагается на строгое предположение, на которое полагаются z-оценка и z *-оценка. Одна проблема с использованием t-статистики и связанных p-значений заключается в том, что на них влияет как размер выборки, так и размер эффекта. Они получены в результате тестирования отсутствия средней разницы и поэтому не предназначены для измерения величины сложных эффектов. Для выбора попаданий наибольший интерес представляет размер эффекта в тестируемом соединении. SSMD напрямую оценивает размер эффектов. Также было показано, что SSMD лучше, чем другие обычно используемые размеры эффекта. Значение популяции SSMD сравнимо в разных экспериментах, и, таким образом, мы можем использовать одно и то же ограничение для значения популяции SSMD для измерения размера сложных эффектов.

Методы повышения производительности и эффективности

Уникальное распределение соединений по одному или нескольким планшетам можно использовать либо для увеличения количества анализов на планшет, либо для уменьшения разброса результатов анализов, либо для того и другого. Упрощающее допущение, сделанное в этом подходе, состоит в том, что любые соединения N в одной лунке обычно не будут взаимодействовать друг с другом или с мишенью анализа таким образом, который фундаментально изменяет способность анализа обнаруживать истинные совпадения.

Например, представьте себе планшет, в котором соединение A находится в лунках 1-2-3, соединение B находится в лунках 2-3-4, а соединение C находится в лунках 3-4-5. При анализе этого планшета против заданной цели попадание в лунки 2, 3 и 4 будет указывать на то, что соединение B является наиболее вероятным агентом, а также обеспечивает три измерения эффективности соединения B против указанной цели. Коммерческие применения этого подхода включают комбинации, в которых никакие два соединения никогда не используют более одной лунки, чтобы уменьшить возможность (второго порядка) интерференции между парами проверяемых соединений.

Последние достижения

Форматы автоматизации и анализа малых объемов были использованы учеными Центра химической геномики NIH (NCGC) для разработки количественных HTS (qHTS), парадигмы фармакологического профилирования больших химических библиотек посредством создания полных соотношений концентрация-ответ для каждого соединения. С сопутствующим программным обеспечением для подбора кривой и хеминформатики данные qHTS дают половину максимальной эффективной концентрации (EC50), максимальный ответ, коэффициент Хилла (nH) для всей библиотеки, что позволяет оценить взаимосвязь активности зарождающейся структуры (SAR).

В марте 2010 года было опубликовано исследование, демонстрирующее процесс HTS, позволяющий проводить скрининг в 1000 раз быстрее (100 миллионов реакций за 10 часов) при 1-миллионной стоимости (используя в 10-7 раз больше объема реагента), чем традиционные методы с использованием капельной микрофлюидики. Капли жидкости, разделенные маслом, заменяют лунки микропланшетов и позволяют проводить анализ и сортировку попаданий, пока реагенты протекают через каналы.

В 2010 году исследователи разработали силиконовый лист линз, который можно разместить над микрожидкостными матрицами, чтобы можно было измерять флуоресценцию 64 различных выходных каналов одновременно с помощью одной камеры. Этот процесс может анализировать 200 000 капель в секунду.

В 2013 году исследователи раскрыли подход с небольшими молекулами растений. В общем, очень важно обеспечить высококачественные подтверждения правильности концепции на ранних этапах процесса открытия лекарств. Здесь технологии, которые позволяют идентифицировать сильнодействующие, селективные и биодоступные химические зонды, представляют решающий интерес, даже если полученные соединения требуют дальнейшей оптимизации для превращения в фармацевтический продукт. Ядерный рецептор RORα, белок, который более десяти лет использовался для идентификации сильнодействующих и биодоступных агонистов, был использован в качестве примера очень сложной лекарственной мишени. На этапе скрининга совпадения подтверждаются колоколообразной кривой. Этот метод очень похож на количественный метод HTS (одновременный скрининг и подтверждение попадания), за исключением того, что использование этого подхода значительно уменьшает количество точек данных и позволяет легко скринировать более 100 000 биологических релевантных соединений.

В то время как при открытии традиционных HTS-препаратов используются очищенные белки или неповрежденные клетки, очень интересное недавнее развитие технологии связано с использованием интактных живых организмов, таких как нематода Caenorhabditis elegans и рыбок данио ( Danio rerio ).

В 2016-2018 гг. Производители планшетов начали производить специализированные химические вещества, чтобы обеспечить массовое производство поверхностей со сверхнизким сцеплением с клеточными репеллентами, что облегчило быструю разработку HTS-тестов для поиска лекарств от рака в трехмерных тканях, таких как органоиды и сфероиды; более физиологически актуальный формат.

Расширение использования HTS в академических кругах для биомедицинских исследований

HTS - относительно недавняя инновация, которая стала возможной в значительной степени благодаря современным достижениям в робототехнике и высокоскоростных компьютерных технологиях. По-прежнему требуется высокоспециализированная и дорогая скрининговая лаборатория для проведения операций по УТВ, поэтому во многих случаях исследовательское учреждение небольшого или среднего размера будет использовать услуги существующего центра УТВ, а не создавать его для себя.

В академических кругах существует тенденция к тому, чтобы университеты были собственными предприятиями по открытию новых лекарств. Эти возможности, которые обычно имеются только в промышленности, теперь все чаще встречаются и в университетах. UCLA , например, имеет открытую лабораторию HTS Molecular Screening Shared Resources (MSSR, UCLA), которая может проверять более 100 000 соединений в день на регулярной основе. Политика открытого доступа гарантирует, что исследователи со всего мира могут воспользоваться этой возможностью без длительных переговоров по интеллектуальной собственности. С составной библиотекой, содержащей более 200 000 малых молекул, MSSR имеет одну из самых больших составных колод среди всех университетов западного побережья. Кроме того, MSSR обладает полными функциональными возможностями геномики (siRNA, shRNA, cDNA и CRISPR), которые дополняют усилия малых молекул: функциональная геномика использует возможности HTS для выполнения широкогеномных скринингов, которые исследуют функцию каждого гена в интересующем контексте. либо выключением каждого гена, либо его сверхэкспрессией. Параллельный доступ к высокопроизводительному скринингу малых молекул и полному геному скринингу позволяет исследователям выполнять идентификацию и валидацию мишеней для данного заболевания или определения способа действия на малой молекуле. Наиболее точные результаты могут быть получены при использовании «упорядоченных» функциональных библиотек геномики, т.е. каждая библиотека содержит единственную конструкцию, такую ​​как одиночная миРНК или кДНК. Функциональная геномика обычно сочетается с скринингом высокого содержания с использованием, например, эпифлуоресцентной микроскопии или лазерной сканирующей цитометрии.

Университет Иллинойса также имеет объект для HTS, как и Университет Миннесоты. В Институте наук о жизни при Мичиганском университете находится объект HTS в Центре химической геномики. Колумбийский университет имеет общий ресурсный центр HTS с ~ 300 000 различных малых молекул и ~ 10 000 известных биологически активных соединений, доступных для биохимического, клеточного и NGS скрининга. Университет Рокфеллера имеет ресурсный центр HTS с открытым доступом HTSRC (The Rockefeller University, HTSRC ), который предлагает библиотеку из более чем 380 000 соединений. Лаборатория высокопроизводительного анализа Северо-Западного университета поддерживает идентификацию, валидацию, разработку анализов и скрининг соединений. Некоммерческий институт медицинских открытий Sanford Burnham Prebys также имеет давнее учреждение HTS в Центре химической геномики Конрада Пребиса, который был частью MLPCN. Некоммерческий исследовательский центр молекулярного скрининга Скриппса (SRMSC) продолжает обслуживать научные круги в институтах после эпохи MLPCN. Средство SRMSC uHTS поддерживает одну из крупнейших библиотечных коллекций в академических кругах, в настоящее время насчитывающую более 665 000 низкомолекулярных объектов, и регулярно проверяет всю коллекцию или подбиблиотеки в поддержку инициатив по грантам с несколькими PI.

В Соединенных Штатах Национальный институт здоровья или NIH создал общенациональный консорциум центров скрининга малых молекул для производства инновационных химических инструментов для использования в биологических исследованиях. Сеть центров по производству зондов для молекулярных библиотек, или MLPCN, выполняет HTS на основе анализов, предоставляемых исследовательским сообществом, в отношении большой библиотеки малых молекул, хранящейся в центральном репозитории молекул.

Смотрите также

использованная литература

дальнейшее чтение

внешние ссылки